199691. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfatidil-inozit előállítására biológiai anyagokból
HU 199691 B 4 Biológiai anyagként alkalmazhatunk növényi magvakat, ezek feldolgozási termékeit, gyökereket, leveleket, szárakat, valamint állati szerveket és mikroorganizmusokat, előnyösen azonban fűfélék magvait és ezek feldolgozási termékeit alkalmazzuk, például korpát alkalmazunk. Az említett biológiai anyagok előnyös volta arra vezethető vissza, hogy ezek a nyersanyagok könnyen hozzáférhetőek és olcsóak, egyidejűleg lehetővé teszik, hogy a foszfatidil-inozitot magas hozammal nyerjük ki belőlük. A biológiai anyagot mozsárban való szétdörzsöléssel, homogenizátorban vagy más alkalmas berendezés alkalmazásával homogenizáljuk. A találmány szerint a biológiai anyag homogenizálását 0,005—1 mól/liter koncentrációjú vizes sóoldatban végezzük. A sóoldatnak ezt a koncentrációtartományát az indokolja, hogy a 0,005 mól/liter alatti sókoncentráció nem kívánatos, mivel a fehérje-foszfatidil-inozit-komplexet oldja, ezáltal a termék előállítását megnehezíti. A sóoldat koncentrációjának felső határa, az 1 mól/liter érték felett a sónak szobahőmérsékleten való oldhatósági határáig alkalmazható a sóoldat. Nem célszerű azonban az 1 mól/liter feletti koncentrációjú sóoldat alkalmazása, mivel az ilyen sóoldat nem növeli a hozamot, nehezebbé teszi az oldat előállítását és felesleges reagens-felhasználással jár. Az előzőekben megadott tartományon belül az optimális sóoldat-koncentráció a 0,05- 0,1 mól/liter. A vizes sóoldat elkészítéséhez tetszés szerinti szerves vagy szervetlen só használható azokon a sókon kívül, amelyek kaotróp tulajdonságokkal bírnak, és amelyek képesek a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex bontására. Különösen célszerűn alkalmazhatjuk a semleges, illetve gyengén lúgos tulajdonságokkal bíró sókat, például a nátrium-kloridot, a foszforsav nátrium-, illetve káliumsóit, valamint a trihidroxi-amino-metán-klorid-, foszfát- vagy szulfátsóit. A biológiai anyagok homogenizálását a találmány szerint egy 5—11 pH-jú vizes sóoldatban végezzük. A vizes sóoldatnak ezt a pH-tartományát az határozza meg, hogy 5 alatti és 11 fölötti pH-értéknél a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék szétbontanak, ami nem megengedhető. Az említett anyagoknak az említett vizes sóoldatokban való homogenizálása során a biológiai anyag szétbomlása következik be, miközben a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék kiválnak, és a vizes sóoldat-fázisba jutnak. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a szét nem roncsolt sejtektől és részecskéktől való elválasztására, amely utóbbiak egyéb foszfolipideket tartalmaznak, a homogenizátumot a találmány szerint centrifugálással vagy szűréssel szétválasztjuk. A homogenizátum centrifugálását 3000 és 30000 g közötti nehézségi gyorsulás mellett végezzük. A nehézségi gyorsulás ha3 tárértékeit az szabja meg, hogy 3000 g érték alatt azok a részecskék, amelyek más foszfolipideket tartalmaznak, nem ülepednek le, hanem a vizes sóoldat-fázisban maradnak, ami a foszfatidil-inozit-terméknek egyéb foszfolipidekkel való szennyeződéséhez vezet. A 30 000 g érték felett már a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék is ülepednek, ami lényegesen csökkenti a termék hozamát. A nehézségi gyorsulás optimális tartománya a 8000 és 10 000 g közötti érték. A homogenizátum elválasztását végezhetjük szűréssel is, olyan szűrőn, amely 3— 5 pm-es pórusátmérővel bír. A homogenizátumnak 3 pm-nél kisebb pórusátmérőjü szűrőn való szűrése nem célszerű, mivel ilyen esetben a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék is a szűrőn maradnak, miáltal a végtermék hozama csökken. Ugyancsak nem kívánatos az 50 pm pórusátmérőnél nagyobb pórusátmérőjű szűrő alkalmazása, mert ezen a vizes sóoldat-fázisba olyan részecskék is bejutnak, amelyek egyéb foszfolipideket tartalmaznak, ezáltal a végtermék minősége lényegesen romlik. A homogenizátumot a fenti eljárások valamelyikével elválasztva sejtmentes vizes sóoldat-fázist nyerünk, amely a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket tartalmazza, valamint egy csapadékot nyerünk, amely más foszfolipideket tartalmaz, ezt a csapadékot eltávolítjuk. A sejtmentes vizes sóoldat-fázisból a fehérje-foszfatidil-inozit részecskéket gélkromatográfiás eljárással különíthetjük el olyan szorbens alkalmazásával, amely lehetővé teszi az 1 000 000 dalton feletti molekulatömegű anyagok elválasztását. Az olyan szorbensek, amelyek az 1 000 000 dalton alatti molekulatömegű anyagokat elválasztják, nem alkalmasak, mert nem teszik lehetővé a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex elkülönítését. Legjobb szorbensnek tartjuk a „Sepharose”, a „Sephakryl" géleket (Pharmacia, Svédország), az „Ultrámért (LKB, Svédország), a „Biogel A"-t (Biorad, Amerikai Egyesült Államok), illetve a „ToyapearT-t (Toya-soda, Japán). A fehérje-íoszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a sejtmentes vizes sóoldat-fázisból való elkülönítését végezhetjük ultraszűréssel is legfeljebb 0,2 pm pórusátmérőjű szűrőn. A 0,2 pm feletti pórusátmérőjű szűrők alkalmazása nem kívánatos, mert a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék a szürletbe átmennek, miáltal a végtermék hozama csökken. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a vizes sóoldat-fázisból való elkülönítését végezhetjük ultracentrifugáié? sál való kiülepítéssel is 30 000 és 100 000 g közötti értéken. Ezt a tartományt az szabja meg, hogy 30 000 g alatt a fehérje-fosziaO- dil-inozit-komplex részecskék kiülepedése nem tökéletes, míg a 100 000 g fölötti értéknél 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
