199563. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nebramicin és neomicin típusú antibiotikumok előállítására
1 HU 199563 A 2 valamilyen módon a hatóanyag vizes oldatát képezzük (pl. Az extrakcióhoz használt oldószer lepárlásával nyerünk vizes oldatot, vagy a komplex só megbontásával visszük oldatba a hatóanyagot), amelynek lugosításával a továbbikaban a már ismertetett módon járunk el. A lúgos pH tartományban végzett ioncsere alkalmazható a hatóanyagnak közvetlenül a szűrt fermentléből történő kinyerésére és egyben tisztítására is. Ebben az esetben úgy járunk el, hogy a szűrt feimentlé pH-ját 10,2-10,8 értékre állítjuk, s a hatóanyagot ezen a pH értéken kötjük meg. A szennyező komponensek, a színanyagok nagy része már ekkor eltávozik a gyengén savas kationcserélő gyantáról az elfolyó oldattal és a mosóvízzel. A gyantán megkötött hatóanyag leoldása és további feldolgozása az ismert technológiai lépésekkel könnyen, jó hatásfokkal megoldható. Eljárásunk e változatának hatékonyságát még fokozza, ha a szűrt fermentlében lévő hatóanyag ioncserélő gyantán való megkötését és az ammóniumhidroxid vizes oldatával történő leoldását is melegen, előnyösen 60 *C-on végezzük. Főleg apramicin tartalmú eluátum esetében - mely különösen sok színanyagot tartalmaz - eljárásunkat előnyösen alkalmazhatjuk úgy is, hogy a pH 9,5-12,0, előnyösen 10,2-11,0 értékre lugosított oldatot adszorpciós gyantára (pl. Diaion SP-207, Diaion-20, Diaion-21, XAD-1184 stb.) visszük, majd az oszlopról elfolyó apramicin tartalmú oldatot és mosóvizet a már ismert technológiai lépésekkel dolgozzuk fel. A találmányunkat az alábbi példákban ismertetjük részletesebben, anélkül, hogy oltalmi igényünket azokra korlátoznánk. 1. példa Streptomyces tenebrarius K-26 jelű, NCAIMB (P)000169 deponálási számú törzzsel a 176.103. számú magyar szabadalmi leírás szerint fermentált 39 m3 nebramicin tartalmú fermentlevet (összaktívitása bioautográfiás értékméréssel 1968 E/ml) oxálsavval pH 2,1 értékre savanyítunk, majd előréteges dobszűrőn szűrünk, közben a szűrőréteget vízzel mossuk. A szűrt lé pH-ját tömény ammónium-hidroxiddal 7,5 értékre állítjuk, s a kivált csapadékot újból szűrjük előréteges dobszűrőn. 67 m3 neutrális szűrt levet 3500 liter ammóniumciklusban levő Lewatit CNP-80 típusú gyengén savas kationcserélő gyantára visszük álló ágyban 2500 1/óra sebességgel. A hatóanyag megkötése után a gyantaágyat 2500 1/óra sebességgel álló ágyban 12 m3 ionmentes vizzel mossuk. A hatóanyag leoldását és szétválasztását előbb 0,1 mólos ammónium-hidroxid oldattal végezzük (37,5 m3), majd 0,3 mólos ammónium-hidroxid oldattal folytatjuk (21 m3). Az eluálást 300 1/óra sebességgel álló ágyban végezzük. A leoldás során az eluátumot 200 literes egységekbe gyűjtjük és vékonyréteg kromatográfiásan vizsgáljuk. Az értéktelen, hatóanyagot nem tartlmazó színes frakciókat kanálisba engedjük. Az apramicin tartalmú frakciókat (ún. „A” frakciót, melynek térfogat 14.500 liter) összegyűjtjük és vákuumban 40 'C-on besűrítjük 30 % szárazanyag tartalomra. A sűrítményt az 5. példa szerint dolgozzuk fel. A karbamoil-kanamicin és karbamoil-tobramicin tartalmú frakciókat (ún. „B” frakciót, melynek térfogata 19.500 liter) vákuumban 40 *C-on besűrítjük. A kapott „B” sűrítményt 227 liter 38,5 % szárazanyag tartalmú, azaz összesen 87,40 kg karbamoil-kanamicint, karbamoil- tobramicint, valamint sok minor komponenst és színanyagot tartalmaz. A 227 liternyi sűrítményt 60 kg nátrium-hidroxiddal 10 órán át 100 'C-on hidrolizáljuk. A hidrolizátumot 25 'C-ra hűtjük, 600 literre hígítjuk ionmentes vízzel. A 13,88 pH-jú oldathoz 180 liter 5 mólos kénsavat adagolunk, s a pH-t 10,61 értékre állítjuk. Az oldatot 3 m1 * 3 térfogatra hígítjuk(szárazanyag tartalom 6,8 %), és álló ágyban 300 1/óra sebességgel 3400 liter ámmónium-ciklusban lévő Lewatit CNP-80 típusú gyantán vezetjük át. A gyantaágyat 10 m3 ionmentes vízzel mossuk 300 1/óra sebességgel. A mosóvízzel a színanyagok és minor komponensek túlnyomó része eltávozik. A gyantán megkötött hatóanyagot 200 1/óra sebességgel álló ágyban 2 %-os ammónium-hidroxid oldattal (összesen 8 m3-rel) oldjuk le. Az eluátumot m3-es részletekben gyűjtjük. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat alapján egyesítjük (térfogat összesen 4 m3) és vákuumban 40 *C-on bepároljuk és ammóniamentesítjük. A kapott sűrítmény 300 liter 21,3 % szárazanyag tartalmú, azaz összesen 63,90 kg kanamicint, tobramicint, valamint kevés minor komponenst és színanyagot tartalmaz. A 300 liter kanamicin és tobramicin tartalmú oldatot 800 literre hígítjuk, a pH-ját 5 mólos kénsavval (60 liter) 7,45 értékre állítjuk. Az oldatot 1500 liter ammónium-ciklusban lévő Varion KCO típusú gyengén savas karboxil-típusú gyantára vezetjük 25 1/óra sebességgel. A gyantaágyat először 200 liter ionmentes vízzel mossuk 25 1/óra sebességgel, majd 2 m3 vízzel mossuk 100 1/óra sebességgel. A hatóanyag szétválasztását 9 m3 0,05 mólos, majd 9 m3 0,10 mólos, végül 39 m3 0,15 mólos ammónium-hidroxid oldattal végezzük álló ágyban 150 1/óra sebességgel. Az eluátumot 200 literes részletekben gyűjtjük és vékonyréteg kromatográfiásan vizsgáljuk. Az értéktelen, hatóanyagot nem tartalmazó frakciókat kanálisba vezetjük. A kanamicin tartalmú frakciókat egyesítjük (térfogata 7400 liter), vákuumban 40 'C-on besűrítjük és ammóniamentesítjük. A kapott sűrítmény 100 liter 15 % szárazanyag tartalmú, azaz összesen 15,00 kg kanamicin-bázist tartalmaz. Az oldat jellemző paramétere: E4%i cm (295 nm) - 0,430 Az oldat pH-ját 20 liter 5 mólos kénsavval 5,7 értékre állítjuk, majd 1,0 kg aktív szénnel derítjük. A szénágyat 10 liter ionmentes vízzel mossuk. A kapott oldat 130 liter 16,5 % szárazanyag tartalmú, azaz összesen 21,45 kg kanamicin-szulfátot tartalmaz. A 130 liternyi oldatot hatszoros térfogatú (780 liter) metanolba csoigatjuk. A kivált kanamicin-szulfát kristályokat kiszűrjük, a csapadékot kétszer 50 liter metanollal szuszpendáljuk, majd vákuumban 50 ‘C-on megszárítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
