199560. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-hidroxikarbonsavaknak a megfelelő l-alfa-aminokarbonsavakká történő folytonosüzemű, enzimatikus átalakítására
HU 199560 B tartjuk. A reakcióelegy pH-ját a reakció alatt célszerűen 8 és 9,5 között tartjuk. A találmány szerinti eljárással a gyakorlatban csak L-a-aminokarbonsavak állíthatók elő, mert D-aminosav-dehidrogenázok eddig még nem állnak rendelkezésre. Egyébként azonban a találmány szerinti eljárás igen sokoldalúan használható. így például L- vagy D- vagy L- és D- laktát-dehidrogenáz-f-flaktát-racemáz (E.C.5.1.2.1.)+L-alanin-dehidrogenáz enzimrendszerekkel a tejsav L-alaninná alakítható át. Az L- vagy D- vagy L- és D- 2-hidroxi-4-metilpentánsav-dehidrogenáz+L- leucin-dehidrogenáz enzimrendszerrel a 2-hidroxi-4.-metilmerkapto vajsav L-metioninná, a 2-hidroxi-3-metilvajsav L-valinná, a 2-hidroxi-4-metilpentánsav L-leucinná vagy a2-hidroxi-3-metilpentánsav L-izoIeucinná alakítható át. Az L- vagy D- vagy L- és D- laktát-dehidrogenáz+L-fenilalanin-dehidrogenáz enzimrendszerrel a fenilvajsav L-fenilalaninná alakítható. Az L- vagy D- vagy L- és D- indolilaktát-dehidrogenáz+L-fenilalanin-dehidrogenáz enzimrendszerrel indoliltejsav L-triptofánná alakítható át. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák világítják meg: 1. Példa 25°C-on tartott, 11,3 ml térfogatú síkmembrán-reaktort, amely mágneses keverővei és egy 62 mm átmérőjű, 5.000 névleges kizárás-határú ultraszűrőmembránnal (gyártómű: Amicon, Witten: YM5 típusú) volt ellátva, sterilizálás céljából egy 11,3 ml/óra szállítási sebességre beállított adagolószivattyú segítségével 5 órán át 70 t%-os vizes etanol oldattal öblítettük át. Ezután további 5 órán át a vizes alkohol oldatot desztillált vízzel szorítottuk ki. Ezután 9,3 ml/óra sebességgel 5 órán át egy steril szűrőn (0,2 pm) átszűrt szubsztrátum oldatot vezettünk a reaktorba, amely 243 mmól/1 DL-tejsavat (nátriumsó-alakjában) és 486 mmól/1 ammóniumformiátot tartalmazott, és amelynek pH-ját nátronlúggal 9-re állítottuk be. Egyidejűleg egy másik adagolószivattyúval ugyanezen a steril szűrőn keresztül, 2 ml/óra sebességgel 5 órán át egy piruvátoldatot táplálunk be, amely 11,3 mmól/1 borostyánkősavat tartalmazott nátriumsó alakjában, és amelynek pH-ját nátronlúggal 9-re állítottuk be. Mindebből a reakció beindulása előtt a reaktorban 200 mmól/1 DL-laktát,400 mmól/1 ammóniumformiát és 2 mmól/1 piruvát kezdeti koncentráció adódott. Ezután a steril szűrő előtt elhelyezett szelepen át az adagolt szubsztrátum áramba egy enzim/koenzim elegyet fecskendeztünk oly módon, hogy a reaktorban 20.000 átlagmolekulasúlyú polietilénglikolhoz kötött NAD+/NADH-ra 1,32 mmól/1 koncentráció, 60,5 E/ml (0,2 mói/1 DL-laktáttal, 2 mmól/1 NAD+-al 26°C-on, pH=9-en mért) L-laktát-dehidrogenáz-aktivitás, valamint 178,6 E/ml (2 mmól/1 piruváttal, 2 mmól/1 NADH-val, 400 mmól/1 ammóniumformiáttal, 25°C-on • 5 pH=9-en mért) L-alanin-dehidrogenáz aktivitás adódott. A reaktort 60 perces tartózkodási idővel, 25°C-on és pH=9-en 6 napon át folyamatosan üzemeltettük. A teljes üzemidő alatt a membránon keresztül a nyomásesés 1,7 bar volt. A maximális kezdeti kitermelés 80%-os volt, ami 6 nap alatt 60%-osra csökkent (a szubsztrátumban lévő L-enantiomerre vonatkoztatott kitermelés). A maximális tér-idő kitermelés 1,92 mól (lXd), ill. 171 g (lXd) volt. A 6 napos üzemidő alatt 10,1 g, ill. 113 mmól L-alanint ([a]!5 =+14,47°) nyertünk. Az enzimatikusan aktív koenzim-koncentráció 6 nap alatt 1,32 mmól/l-ről 0,49 mmól/l-re csökkent. Egy mól (elhasznált) koenzimre 12.000 mól termék képződött. Ez 615 mg NAD+ (natív) szükségletnek felel meg 1 kg termékre. 6 2. Példa 25°C-on tartott, 10,0 ml térfogatú síkmembrán-reaktort, amely mágneses keverővei, és egy 62 mm átmérőjű, 5.000 névleges kizárási határú ultraszűrőmembránnal (gyártómű: Amicon, Witten: YM5 típusú) volt ellátva sterilizálás céljából egy 20 ml/óra szállítási sebességre beállított adagolószivattyú segítségével kb. 2 órán át 0,05 tömeg%-os vizes perecetsav oldattal öblítettünk át. Ezután további 10 órán át a sterilizáló oldatot desztillált vízzel szorítottuk ki. Ezután 10 ml/óra adagolási sebességgel 4 órán át egy steril szűrőn keresztül (0,2 pm) olyan szubsztrátum-oldatot vezettünk a reaktorba, amely 400 mmól/1 DL-2-hidroxi-4-metilmerkaptovajsavat („DL-hidroximetionin“), 800 mmól/1 ammóniumformiátot és 1 mmól/1 2-keto-4-metilmerkapto-vajsavat tartalmazott, és amelynek pH-ját nátronlúggal 8-ra állítottuk be. Egy másik reaktorban (főzőpohárban) 25 ml ugyanilyen koncentrációjú szubsztrátum oldatot, amely L-leucin-dehidorogenáz és L-2-hidroxi-4-metilpentánsav - dehidrogenáz enzimeket és koenzimként 20.000 átlagmolekulasúlyú polietilénglikolhoz kötött NADH-t tartalmazott, 24 órán keresztül reagáltattunk. Itt olyan enzim- és koenzim koncentrációkat használtunk, hogy 24 óra alatt legalább olyan kitermelést érjük el, mint amilyenre a későbbiekben a folytonosüzemű kísérletben törekedtünk. Ezt az oldatot 2,7 ml/óra szállítási sebességgel ezután a síkmembrán-reaktorba adagoltuk. Ezt követően ugyanilyen sebességgel adagoltuk tovább a fentiekben megadott szubsztrátum-oldatot. Mivel az enzimek és a koenzim a reaktor előtti steril szűrőn áthatolhattak, a reaktor ultraszűrőjén azonban nem, a reaktorban 1,42 mmól/1 koenzim-koncentráció, 4,0 E/ml L-2-hidroxi-4-metilpentánsav - dehidrogenáz aktivitás (0,4 mól/1 DL-2-hidroxi-4-metil-merkaptovajsavval, 0,1 mól/1 triszpufferrel, 1 mmól/1 NAD+-al, 25°C-on, pH=8-on mérve), és 86,3 E/ml L-leücin-dehidrogenáz ak-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
