199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
HU 199558 B letet 25°C hőmérsékletre hűtjük és 500 ml térfogatra hígítjuk. Az oldat forgatóképességét (R2) egy 2 dm-es cellában, 25°C hőmér.sékleten határozzuk meg. Egy összehasonlító mintát készítünk ugyanilyen módon, azzal a különbséggel, hogy enzimet nem adunk hozzá. Az összehasonlító minta optikai forgatóképességét (R,) szintén 25°C hőmérsékleten határozzuk meg. Az izomerizáció fokát az alábbi egyenlet alapján számítjuk ki: (R*-R.) 1 =-----------aCpL ahol a fajlagos forgatóképesség változás, ha a fruktóz teljesen átalakul dextrózzá, cpa cukoroldat koncentrációja (0,15 g/ • /ml) és La polariméter cső hosszúsága (2 dm). Az izomeráz aktivitás fix aktivitás-egységeit (FAU) az alábbi képlet alapján számítjuk ki: FAU/g=JC/Kftw ahol K/egy sebességkonstans (1,21 I óra-1 FAU-1 mg glükóz), t a reakcióidő órákban kifejezve (1 óra) w a minta tömege g-ban, C a kezdeti koncentráció mg/125 ml reakcióelegy (75,000 mg glükóz), és J az alábbi egyenlettel fejezhető ki: J-iwfc+D+wi^-nn»^,)ahol I»=az izomerizáció foka egyensúlyi állapotban, a fruktóz móltörtjében kifejezve (0,513) I =az izomerizáció foka a fruktóz móltörtjében kifejezve 7 Cm=a glükóz kezdeti mólkoncentrációja (3,33 M) Kj=a glükózra vonatkozó Michaelis konstans (0,7 M) 5 Kp=a fruktózra vonatkozó Michaelis konstans (1,43 M) 1 IGIU egyenlő 15,8 FAU-val. Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást szemléltetik anélkül, hogy 10 találmányunkat ezekre a példákra korlátoznánk. 1. példa A példában egy oldhatatlan glükóz izo- 15 meráz-amin komplex előállítását írjuk le, amely komplex azután egy ionos oldatban disszociál és tiszta aktív glükóz izomeráz keletkezik. 20 A glükóz izomeráz extraktumot a Streptomyces nemzetség valamilyen kiválasztott törzsével állítjuk elő és pH-ját pH=7,2 értékre állítjuk be. Az extraktum izomeráz aktivitása 40 IGIU/ml. Kilenc mérőedény mindegyiké- 25 be 25 ml enzim extraktumot mérünk (összesen 1000 IGIU). Mindegyik edénybe megfelelő mennyiségű BTC-835-öt C,2-l6 alkil-dimetil-benzil-ammónium-klorid, Onyx Chemical Co., Jersey City, New Yersey) adago- 30 lünk szobahőmérsékleten, 15 percig tartó folyamatos keverés mellett. A BTC hozzáadása fehér pelyhes csapadék képződését eredményezi még a legkisebb hozzáadott menynyiség (100 ppm) hatására is. 35 A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk és az elfolyó folyadékot megvizsgáljuk az izomeráz aktivitás szempontjából. Az eredmények az I. táblázatban láthatók. 8 I. táblázat Kísérlet /BTC/ ppm Oldható izomeráz aktivitás IGIU/ml % Visszamaradó elfolyó folyadék frakció 1 0 40 100 2 100 40 100 3 500 20 50 4 1000 0 0 5 1500 0 0 6 2000 0 0 7 3000 0 0 8 4000 0 0 9 5000 0 0 5
