199508. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF peptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199508 B mázott reakciókörülmények között a szintézis minden lépésében stabilnak kell maradnia, c) az oldalláncra felvitt védőcsoport eltávolítható kell hogy legyen a kívánt aminosav-szekvencia kialakítása után olyan körülmények között, amely a peptid láncot nem változtatja meg. A szilárd fázisú szintézis során a peptidet a C-terminális végén kezdjük kialakítani egy védett a-amino-savnak egy megfelelő gyantához való kapcsolásával. Ilyen kiindulási anyagot úgy állítunk elő, hogy egy a-amino-csoportján védett aminosavat észterkötéssel egy klórmetilezett vagy hidroximeti(csoportot tartalmazó gyantához kapcsolunk, vagy egy amid-kötéssel egy BHA vagy MBHA gyantához kötjük. Ha kapott polipeptidbe metil-, etil- vagy propil-amidot szándékozunk beépíteni, klórmetilezett vagy hidroxi-metil-csoportot tartalmazó gyantát használunk, és a lehasítást előnyösen egy megfelelő aminnal, például etil-aminnal végezzük. Például ha a 40 aminosav-csoportból álló fragmenst akarunk előállítani, a BOC csoporttal védett alanint Monahan és Gilon (Biopolymer 12, 2513—19 /1979/) módszere szerint egy klórmetilezett gyantához kapcsoljuk. A gyanta hordozóhoz való kapcsolás után az a-amino védőcsoportot trifluor-ecetsav (TFA) és metilén-klorid keverékével, trifluor-ecetsavval vagy sósavas dioxánnal távol ítjuk el. A védőcsoport eltávolítást 0°C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Egyéb általánosan használt lehasító reagenseket és az a-amino-védőcsoportok eltávolítására szolgáló speciális körülményeket Schroder és Lubke „The Peptides" (Academic Press, 1965) c. könyve 1. kötetének 72—75. oldala írja le. A Phe a-amino-védőcsoportjának lehasítása után a maradék a-amino- és az oldalláncban védett a-aminosavat lépésenként a kívánt sorrendben összekapcsoljuk, így a fentiekben definiált intermedier vegyületet kapjuk. Egy alternatív módszer szerint az aminosavakat a szilárd fázisú reaktorba való bevezetés előtt egymással is összekapcsolhatjuk. A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása az adott területen jártas szakember ismeretkörébe tartozik. Kapcsoló reagensként különösen előnyösen N,N’-diciklohexil-karbodiimidet (DCCI) alkalmazhatunk. A peptidek szilárd fázisú szintéziséhez használt aktiváló reagensek a peptidkémiában jól ismertek. Megfelelő aktiváló reagensként a karbodiimideket, például az N.N’-diizopropil-karbodiimidet és az N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimidet említhetjük. Egyéb aktiváló reagenseket és ezek használatát Schroder és Lubke fenti könyvének III. fejezete és Kapoor [J. Phar. Sei. 59, 1—27. (1970)] cikke írja le. Minden védett aminosavat vagy aminosav szekvenciát a szilárd fázisú reaktorba 5 4 legalább négyszeres mennyiségben vezetünk be és a kapcsolást dimetil-formamid (DMF): :diklór-metán 1:1 arányú elegyében, vagy dimetil-formamidban vagy diklór-metánban hajtjuk végre. Abban az esetben, ha a kapcsolás nem tökéletes, a kapcsolási eljárást megismételjük a következő aminosavhoz kapcsolást megelőző a-amino védőcsoport eltávolítása előtt. Minden lépésben a kapcsolás sikerét a ninhidrin reakciójával követjük nyemon, mint az E. Kaiser és társai az Anal. Biochem. 34. 595 (1970)-ben leírták. A kapcsolási reakciókat automatizálhatjuk egy Beckman 990 Peptide Synthetizerben a Rivier és társai által (Biopolymers, 1978, 17, 1927—38.) leírt program szerint. Miután a kívánt aminosav szekvenciát kialakítottuk, az intermedier pepiidet a gyanta hordozóról egy olyan reagens — például folyékony hidrogén-fluorid — segítségével távolíthatjuk el, mely nem csak a pepiidet hasítja le a gyantáról, de felnyitja az összes oldallánc védőcsoport és az lehasítja az a-amino védőcsoportot is, így a pepiidet szabad sav formájában kapjuk. Ha Met van jelen a peptid szekvenciájában, a BOC védőcsoportot először előnyösen trifluor-ecetsav (TFA) és etán-ditiol elegyével távolítjuk el, mielőtt a pepiidet hidrogén-fluoriddal a gyantáról lehasítanánk, hogy a lehetséges S-alkileződést elkerüljük. Ha a hidrogén-fluoridot alkalmazunk a hasításra, anizolt és metil-etil-szulfidot használunk a reakcióedényben tisztítás céljából. A következő példa a phGRF analógok szilárd fázisú technikával való szintézisének előnyös megvalósítási módját illusztrálja. Természetesen amennyiben a megfelelő rövidebb peptid fragmenst kívánjuk előállítani, ezt hasonló módon tehetjük, pusztán a megfelelő számú aminosavnak a peptid C-terminális részéről való eltávolításával. 1. példa A H-Tyr-Ala-Asp-Ala-1le-Phe-Thr-Asn-Ser -Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-lle-Ser -Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 képletű [Ile27]-hGRF (1-40)-NH2 előállítása A szintézist lépésenként hajtottuk végre Beckman 990 Peptide Synthetizeren MGHA sósavas gyantát (Bachem Inc., szubsztitúciós készség: 0,1—0,5 millimól/g gyanta) használva. A BOC-Ala gyantához való kapcsolását a szokványos módszerrel végeztük. A reagenseket az A és B táblázatban ismertetjük. 0,35 millimól Ala/g gyanta terméket kaptunk. Az összes használt oldószert óvatosan eltávolítottuk egy inert gáz, például hélium vagy nitrogén bevezetésével, hogy az oxigén jelenlétét, és ezáltal a Met maradék kénatomjának nemkívánatos oxidációját elkerüljük. A védőcsoportok eltávolítása és semlegesítés után a peptidláncot lépésenként épít-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
