199494. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szacharidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 199494 B noil]-2-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amido]-ß-D-glükopiranozil] -2,3-di-O- [( R)-3-hidroxi-tetfadekartoiI]-l-0-foszfono-a-D-glükopiranóz 2,03 mg UDP-2-dezoxi-3-0-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -2- [(R)-3-hidroxi-tetradekanoîl-amido] -1 -O-íoszfono-a-D-glükopiranózt ésB,42 mg 2,3-di-O- [ (R) -3-hidroxi-tetradekanoil] -1-0-foszfono-a-D-glükopiranózt, mindkettőt trisz só formájában 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 7 pH-értékű 10 mM trisz-pufferban feloldunk és 60 pl enzimextraktummal 30°C-on inkubálunk. Az enzimextraktumot a következőképpen készítjük el: E.coli JB 1104 sejteket tenyésztünk L-levesben (előtenyészet + 10 pg ampicillin/ml, 30°C-on éjszakán át; főtenyészet 30°C-on, keverős inkubátorban; a kiindulási sűrűség OD55onm=0,l, a végső OD550 ,*=1). A sejteket kicentrifugáljuk (10.800 g, 10 perc/4°C), az üledéket 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTE- et tartalmazó 7 pH-értékű 10 mM trisz-pufferban szuszpendáljuk és újra centrifugáljuk (6000 g, 10 perc/4°C). Az üledéket a fenti pufferban újra szuszpendáljuk és ultrahanggal fragmentáljuk (5X20 mp/30 mp-es szünetekkel, 120 wattal). A sejtfragmentumokat kicentrifugáljuk (12.000 g, 10 perc/4°C) és az oldatot ultracentrifugáljuk (150.000 g 90 perc/7°C). A felüluszó .felső 2/3 részét elkülönítjük. Ezt a frakciót ammónium-szulfáttal frakciónált kicsapásnak alávetjük. Ehhez 10— 40% ammónium-szulfátot használunk. A kapott üledéket a fenti pufferban szuszpendáljuk. Miután a reakció végbement (ellenőrizzük vékonyréteg-kromatográfiával) az oldatot citromsavval 2 pH-értékre savanyítjuk és centrifugáljuk. Az üledéket kloroform/metanol/ecetsav/víz 65:15:5:2 arányú keverékében szuszpendáljuk és ugyanezzel az eluenssel kovasavgélen kromatografáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk, amig szerves oldószer már nem marad vissza, és a maradékot liofilizáljuk. A liofilizátumot tetrahidrofurán/víz 8:2 arányú keverékében feloldjuk és ebben az oldószerben trisz-formában lévő kationcserélőn írisz sóvá alakítjuk. A tetrahidrofuránt lepároljuk, és a maradékot liofilizáljuk. Az R/-értékeket kovasavgél-lemezeken határozzuk meg. Rf=0,48 (kloroform/metanol/ecetsav/víz, 65:25:5:5). Kitermelés 29%. 2 2. példa 6-0-[2-Dezoxi-3-0- [(R)-3-hidroxi-tetradekanoíl] -2- [( R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amido] - -ß-D-glükopiranozil] -2-dezoxi-3-0- [ ( S ) -3- -hidroxi-tetradekanoil] -2-( S)-3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -1-0-foszfono-a-D-glükopiranóz 2-dezoxi-3-0- [ (S) -3-hidroxi-tetradekanoil] -2- [ (S) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -1 -0- -foszfono-a-D-glükopiranóz 20 térfogatrész 5 mM oldatát 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7), UDP-2-dezoxi-3-0-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -2- [ (R) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -I -O-foszfono-a-D-glükopiranóz 20 rész 5 mM oldatát a fenti pufferban és 2 mM EDTA-t és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 20 rész 100 mM trisz-HCI puffert reagáltatunk 40 rész 1. példa szerint előállított enzimkészítménnyel 2 mM EDTA-at, 2 mM DTE-et és 0,1% Triton X-100-at tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7) 30°C-on 8 órán át, miközben a Triton X-I00 végső koncentrációját 0,1%-ra állítjuk be. A reakciókeveréket liofilizáljuk, feloldjuk az eluens kezdeti térfogatának körülbelül 1/3 részében, amit az ezután következő, a molekulatömeg szerinti szétválasztás céljából végzett kromatografáláshoz használunk (Sephadex LH 20, eluens: piridin/ecetsav/víz, 98:1:1) és megszűrjük. Az oszlop térfogata körülbelül 20-szor nagyobb, mint a minta térfogata. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat elkülönítjük, csökkentett nyomáson koncentráljuk, pirogén anyagoktól mentes vízben szuszpendáljuk és liofilizáljuk. Liofilizálás után a Triton X-100-at dietil-éterrel kezelve eltávolítjuk. Újabb centrifugálás után az üledéket kloroform-metanol 1:1 arányú keverékében feloldjuk, megszűrjük és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A mono-L-lizin só előállítása céljából az L-lizin (szabad bázis) számított sztöchiometrikus mennyiségét 100 mM vizes oldat formájában a maradék vizes szuszpenziójához adjuk és a keveréket újra liofilizáljuk. R/=0,44 (kloroform/metanol-ecetsav/víz, 65:25:5:5). Kitermelés 42%. 3. példa 6-0-[2-Dezoxi-3-0-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoit] -2- [ ( R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amido] - -ß-D-glükopiranozil] -2-dezoxi-3-0- [( R)-3- -hidroxi-tetradekanoií] -1 -0-foszfono-2- [( R)-3-tetradekanoil-oxi-tetradekanoi!-amido] -a-D-glükopiranóz 2-dezoxi-3-0- [(R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -1 -0-foszfono-2- [ ( R) -3-tetradekanoil-oxi-tetradekanoil-amido]-a-D-glükopiranóz 20 rész 5 mM oldatát 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7), UDP-2-dezoxi-3-0- [ (R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -2- [ (R) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -1-0-foszfono-a-D-glükopiranóz 20 rész 5 mM oldatát a fenti pufferban és 2 mM EDTA-et és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 20 rész 100 mM trisz-HCI puffert (pH=7) reagáltatunk 40 rész 1. példa szerint előállított enzimextráktummal, 2 mM EDTA-at, 2 mM DTE-et és 0,1% Triton X-100-at tartal- X-100-at tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7) 30°C-on 48 órán át, miközben a Triton X-100 végső koncentrációját 0,1-re beállítjuk. A keveréket liofilizáljuk, piridinnel kezeljük és szűrjük, a szürletet csökkentett nyomáson koncentráljuk és kovasavgélen kromatografáljuk, eluensként kioroform/metanol/víz/2-fenetil-pikoIinium-bromid 80:175: 12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
