199446. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metiléndioxi-fenantrén- és sztilbén-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199446 B gyület intraperitoneális alkalmazásával mutatjuk be. A stimulálás olyan folyamat, amely bizonyos időt vesz igénybe. A fagocitózis aktivitásának a vizsgálatát ezért mint szokásos farmakológiai modellt, egereknek a találmány szerinti vegyületekkeí végzett háromnapos előkezelése után végezzük. Egyes kísérleti csoportoknál az intraperitoneális sejtpopulációt közvetlenül a vegyület beadása után eltávolítottuk, annak kimutatására, hogy megfigyelt stimulálás csak bizonyos inkubációs idő után lép fel. Kísérleti vegyületek és anyagok A vizsgálandó anyagokat 0,5 mg/ml töménységben vízben feloldottuk és ezt az oldatot szükség szerint hígítottuk. N H 4CI-trisz-puffer NH4 8,3 g/liter írisz [trisz (hidr- 4,119 g/200 ml (pH=7,65 oxi-metil)-amino-metán] keverék 1 rész trisz-|-9 rész NH4C1, 2n sósavval 7,2 pH-értékre beállítva PBS/BSA 40.0 g NaCI 1.0 g KCl vízzel 51 ml-re feltöltve, 7,2 g Na2HP04X pH=7,4 X2H20 1.0 g kh2po4-(-0,2 g BSA (marha szérumalbumin, Sigma, No. A-9647) 100 ml PBS-re (foszfáttal pufferolt sóoldat). DMEM Dulbecco által módosított Eeagle tápoldat, L-glutaminnal, fenolvörös nélkül (Gibco, kat.szám 041-1885) +5% FCS (magzati borjuszérum), illetve +5% FCS+0,2% heparin FCS fetális (magzati) borjúszérum (Gibco, kat.szám: 011—6290) May-Grönwald-oldat módosított (Merck, Art. 1424) Ürüvér Nr.5, 30.08.84., MPL Freiburg Antiszérum Anti-ürü-eritrocita szérum nyulakból, Nr. 308, IKA 468/6—11 nap; 18.07.78, MPI Freiburg Kísérleti állatok. A kísérleteket 18 hetes nőstény FI hibrid egerekkel (Balb/cxC57B16) végeztük. Az állatokat a kísérletek megkezdése előtt 5 napon át szoktattuk a laboratóriumi körülményekhez. Az állatok a patkányok és egerek részére szokásos szemcsés standard eledelt (Altromin Nr. 1324) kapták és csapvizet tetszés szerint. Az állatokat tioglikolát standarddal három makrofág-stimulálhatóságra megvizsgáltuk, ennél a vizsgálatnál jó pozitív reakciókat mutattak. 3 4 Adagolás és alkalmazás A vegyületeket vizes oldatban (0,5 mg/ml) a következő dózisokban alkalmaztuk: intraperitoneálisan: 20 fig/kg 500 pg/kg 5 mg/kg A különböző dózisok alkalmazásához a törzsoldat hígítása a következő volt: 20 pg/kg 1 jig/ml 500 pg/kg 25 pg/ml 5 mg/kg 250 pg/ml és ezekből mindenkor 0,4 ml-t használtunk. Alkalmazási séma 1 csoport=5 egér Előkezelés: a) három beadás három egymást követő napon, a negyedik napon a markofág kitermelése, b) egy beadás közvetlenül a makrofág kitermelése előtt. A makrofág-sejiszuszpenzió előállítása és a fagocitózis A kísérlet elve. Immunológiásan aktiváló anyagok beadása után a kísérleti állatokban a makrofágok stimuiálódnak és a monociták makrofágokká differenciálódnak. A kidifferenciálódott, stimulált makrofágok izolálás után is képesek a megfelelő antitestekkel opszonifikált antigénstruktúrákat, ebben az esetben az ürü-eritro- Oitákat in vitro fagocitálni. A fagocitált eritrociták (vörösvérsejtek) mikroszkóposán felismerhetők. A kísérlet elvégzése. Megfelelő előkezelés után az egereket nyakcsigolyájuk eltörésével megöljük. A hashártyát feltárjuk és 5% magzati borjúszérumot és 0,2% heparint tartalmazó 4 ml DMEM tápoldatot intraperitoneálisan beadunk. Körülbelül 30 mp masszázs után fecskendővel 3 ml sejtszuszpenziót leszívunk és' 0°C-on hűtőfürdőben lévő polipropiléncsövecskébe eresztjük. Mindegyik csoportból 1 egeret arra használunk, hogy az izzadmányban a sejtkoncentrációt megállapítsuk, körülbelül 4X105 sejt/ /ml koncentrációt állítunk be. Adherens makrofágok izolálása. A makrofágokat és monocitákat az izolált sejtpopulációból úgy választjuk ki, hogy a sejtpopulációt fedőlemezeken inkubáljuk, ilyenkor a makrofágok és a monociták a lemezhez tapadnak, a többi sejt nem. 24 tartállyal ellátott szövettenyésztő lemezekre (polisztirol, Costar) kerek fedőlemezkéket helyezünk és ezekre 5% magzati borjúszérumot tartalmazó 0,25 ml DMEM tápoldatot rétegzünk. A sejtek egyenletes eloszlása céljából a lemezeket rázógépre tesszük és rázás közben (5 perc, körülbelül 200 ford./perc) mindegyik adaghoz 0,25 ml sejtszuszpenziót pipettázunk. Ezután a szövettenyésztő lemezeket 1 órán át 37°C hőmérsékletű, 8% C02-ot tartalmazó tenyésztőszekrényben inkubáljuk. Az inkubálás után a nem tapadó sejteket leszivatjuk és a többit 5% magzati borjúszérumot tartalmazó 0,25 ml DMEM tápoldattal kétszer mossuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 05 3
