199168. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új makrolid-antibiotikum és az új antibiotikumot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
199168 (6 mm-es agartálkával mérve). A tenyészlét a 6. példa szerint dolgozzuk fel. 5. példa Streptomyces sp. Y-84,30967 tenyésztése swalpamicin előállítása céljából A 3. példa szerint járunk el az alábbi eltérésekkel. A termelő közeg összetétele 13 pepton 10,0 g marhahúskivonat 5,0 g glükóz 20,0 g NaCl 5,0 g CaC03 3,0 g desztillált víz 1 liter pH 6,5 A fermentálást 46 órán át végezzük, utána a tenyészlé pH-ja 6,5, az elválasztott sejtvolumen 27 tf%-ot tesz ki. Az agartálka módszerével mért aktivitás 16 mm átmérőjű gátlás! zónát mutat ki. A tenyészlét a 7. példa szerint dolgozzuk fel. 6. példa A swalpamicin elkülönítése és tisztítása A 2. példa szerint kapott tenyészlét a micélium elválasztása céljából centrifugáljuk. A kapott szűrlet (232 1) pH-értékét szükség esetén 2n sósav-oldattal 6,5 értékre állítjuk, és a szűrletet 2X120 liter etil-acetáttal extraháljuk. A vizes részt kiöntjük, a szerves fázisokat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. 165 g nyers extraktumot kapunk. A micéliumot (14,5 kg) 2X45 liter acetonnal extraháljuk. Az aceton eltávolítására az egyesített extraktumokat vákuumban bepároljuk. Az így kapott vizes réteg pH-ját 2n nátrium-hidroxid-oldattal 6,5-re állítjuk, 20 liter vízzel hígítjuk és 3X20 liter etil-acetáttal extraháljuk. A vizes részeket kiöntjük és az egyesített extraktumokat vákuumban szárazra pároljuk. Mintegy 110 g nyers extraktumot kapunk. A szűrletből származó extraktumot és a micéliumból származó extraktumot egyesítjük (275 g), 1 liter 10%-os vizes metanolban oldjuk és 4X1 liter heptánnal kezeljük. A heptánt kiöntjük, és a vizes fázist csökkentett nyomáson betöményítjük. A metanol eltávolítása után a vizes réteget 2X 500 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformos fázisokat csökkentett nyomáson bepároljuk. 110 g nyers antibiotikumelegyet kapunk. Ezt a 110 g terméket kétszer egymás után 3,5 kg 37—50 pm szűrőpórusú Kieselgélt tartalmazó oszlopra adjuk és kloroform/metanol 97:3 arányú elegyével eluáljuk. így 6 g aktiv A-frakciót és 80 g B-frakciót kapunk. A B-frakciót ismételt Kieselgéles kromatografálással (2,4 kg Kieselgél, 70—140 pm) tovább tisztítva 9 g félig tiszta kalkomicint és további aktív frakciókat kapunk. 1 g félig tiszta kalkomicint preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel 0,5 mm vastagságú kieselgél-lemezeken tisztítunk, 70 mg tiszta kalkomicint nyerünk. A 8 terméket a fizikai-kémiai tulajdonságai, valamint spektroszkópiai elemzés alapján azonosítjuk. További tisztítás céljából az A-frakciót 600 g RP 18 típusú kieselgéllel töltött oszlopra adjuk fel, majd metanol és víz 7:3 arányú elegyével eluáljuk. 85 mg félig tiszta swalpamicint kapunk, amelyet preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel 0,5 mm vastagságú Kieselgél-lemezeken tovább tisztítunk kloroform és metanol 90:10 arányú elegyével. A tisztítás utolsó lépése nagynyomású folyadékkromatográfiás módszer, p-Bondapak C 18 típusú oszlopon (Waters), eluáló folyadékként metanol és víz 7:3 arányú elegyét alkalmazzuk. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, detektálás UV-detektorral 280 mm hullámhossznál. 23 mg tiszta swalpamicint kapunk. A terméket kémiai elemzés és spektroszkópiai módszerek alapján azonosítjuk. A termék tulajdonságai a leíró részben megadottak. 7. példa Swalpamicin elkülönítése és tisztítása A 3. példa szerint kapott tenyészlé 62 literjét a micélium eltávolítása céljából centrifugáljuk. A szűrletet 2X30 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük és rotációs bepárlóban szárazra pároljuk, ami 12 g nyers extraktumot eredményez. A micéliumot 2X6 liter acetonnal extraháljuk. Az acetonos extraktumokat egyesítjük és az acetont eltávolítjuk. A megmaradt vizes réteget 10 liter etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist szárazra pároljuk, 8 g nyers extrakutmot kapunk. A micélium és a szűrlet nyers extraktumait (20 g) egyesítjük és 100—200 szűrőpórusú Kieselgélen többszörösen oszlopkromatográfálásnak vetjük alá, kloroformból és 10 tf%-ig fokozatosan növekvő metanolrészből álló gradienssel. E módszerrel 2 g bioaktiv frakciót kapunk, amelyet 40—60°C forrástartományú petroléterrel eldörzsölünk. 1,5 g olajos, inaktív maradékot és 360 mg bioaktív csapadékot kapunk. A csapadékot kis mennyiségű metanolban oldjuk és 70X X3,5 cm méretű Sephadex LH-20 típusú oszlopra adjuk, majd metanollal eluáljuk. Mintegy 260 mg félig tisztított antibiotikum-elegyet kapunk, amelyet 0,5 mm vastagságú Kieselgél-lemezeken 10% metanolt tartalmazó kloroformmal tovább tisztítunk. így 150 g kalkomicint (kromatográfiailag, színképelemzéssel és fizikai-kémiai tulajdonságai alapján azonosított), 10 mg bioaktív anyagot és 12 mg swalpamicint kapunk. A swalpamicint kémiai elemzéssel és színképelemzéssel azonosítjuk. A termék színképei, tulajdonságai a leíró részben megadottal egyeznek. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) képletű makrolid-antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
