198965. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás penicillin származékok előállítására
A találmány tárgya új eljárás /?-laktám antibiotikumok előállítására, közelebbről penicillin antibiotikumok enzimalikus úton történő előállítására. A folyamatban szereplő enzim, az izopenicillin-N-szinleláz (1PNS; "cikláz") jól ismert képessége, bogy a 2-(L-o-amino-adipoil)-L-ciszteinil- D-valint izopenicillin-N-né zárja. J. E. Baldwin és munkatársai (J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1211, (1984)] tisztított enzimmel kimutatták, hogy a nevezett enzim cefám- és penámvázú gyűrűs rendszereket képes kialakítani. A találmány tárgya eljárás (9) általános képletű — ahol R és R{ jelentése egymástól függetlenül 1 — 4 szénatomszámú alkilcsoport — /?-laktámok előállítására, mely abból áll, hogy pH = 6 — 9 kémhatású vizes közegben, oxigén, vas(II)-ion és aszkorbinsav jelenlétében egy (9) általános képletfl — ahol R és R] jelentése azonos a fentebb tett meghatározásokkal — dipeptidet izopenicillin-N-szintetáz enzimmel inkubáljuk. Eddig az irodalomban a találmány szerint előállított vegyületeket 6-amino-penicillánsav vagy észtere m-védett karboxi-fenilecetsav származékkal például savhalogeniddel, aktív észterrel vagy anhidriddel végzett kémiai acilezésével nyerték. így az eddigi eljárás során a fenil-ecetsav m-karboxiesoportján védőcsoportot kellett alkalmazni, és ezenkívül aktív származék készítése volt szükséges. Az acilezés után az m-karboxi csoportról le kellett hasítani a védőcsoportot. Az ismert acilezési eljárások során szerves oldószert alkalmaztak. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárás enzim reakció, melyet vizes közegben enyhe körülmények között végzünk. így a szerves oldószer alkalmazása nem szükséges, így elkerülhető a környezeti szennyezés. Ezenkívül az a felismerés, hogy az m-karboxi-fenilacetilcsoport a természetes tripeptid a-amino-adikoril csoportján helyettesíthető, lehetővé teszi, hogy egy szubsztrát az N-(m-karboxi-fenilacetil)-L-cisztcinil-D-valin (vagy módosított valin) könynyebben legyen előállítható, mint a természetes tripeptid kémiai átalakításával. A találmány szerint a szabad m-karboxiesoportot nem kell védeni, majd a védőcsoportot lehasítani. Ezért a találmány szerinti eljárás lényegesen haladóbb az eddig ismert eljárásoknál. Az 1 - 4 szénatomszámú alkücsoporton metil-, etil-, n-propil-, izopropil-, m-butil-, szek-butil-, izobutii- és terc-butil-csoportot értünk. Az eljárásban alkalmazott izopenicillin-N- szintetáz enzimhez több forrásból is hozzájuthatunk, így például Cephalosporium aoremoniumból, például a C. acremonium ATCC 48272 és az ATCC 36225 törzsekből, Penicillin chrysogcnumbói, Aspergillus nidulansbói, Slreptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből és Streptomyces lipanii ATCC 27357-ből. Az enzimet félig tisztított, sejtmentes extraktumként vagy — előnyösen- tisztított preparátumként alkalmazzuk. A tisztítást például Pang és munkatársai (Biocheín. J. (1984)222, 789-7951 vagy J. E. Baldwin és munkatársai [FEBS Utters, (1985), 188. 235) módszerével végezzük. Előnyös enzimforrás a Cephalosporium aeremonium. A (9) általános képlet ű dipeptidet ismert kapcsolási reakciókkal állíthatjuk elő. így például a kénatomján és a karboxilcsoportján védett L- ciszteinil-D-valint vagy L-ciszteinil-D-valinszármazékot karboxilcsoportján védett 3-karboxi-fenil-ecetsawal acilezzük a 2-etoxi-N-eto»-karbonil-l,2-dihidrokinolin (EEDQ) módszerrel, majd eltávolítjuk a védőcsoportokat. A "valinszármazékon” itt olyan különféle aminosavakat értünk, amelyek a (3) általános képlettel jellemezhetők, és amelyeket ciszteinnel a (9) általános képlelű szubsztráttá kapcsolunk össze. Ezek a valinszármazékok a természetes tripeptid valinját helyettesítik és ily módon tágabb értelemben valinszármazékoknak tekinthetők. A "valinszármazékok" előállítására ismert módszereket, vagy azok módosított változatait használjuk, amelyekre a későbbiekben példákat adunk meg. A (9) dipeptid szubsztrátot általában 0,1 mM és 5 mM közötti koncentrációkban használjuk. A szubsztrátnak viszonylag tisztának és például nehézfém szennyeződésektől mentesnek kell lennie, mert ezek gátolják az enzimet. A jobb eredmény érdekében az izopenicillin-N-szintetáz enzimet a szubsztráthoz viszonyítva nagy feleslegben alkalmazzuk. Az enzimaktivitás mérésére Pang és munkatársai (1. fentebb) által leírt módszert használjuk. Az enzimaktivitást olyan egységekben fejezzük ki, ahol egy egység azonos azzal az enzimmennyiséggel, mely a természetes L-a -amino-6-adipinil-L-ciszteinil-D-valin tripeptidből percenként 1 /«mól izopenicillin-N-t készít. A folyamatot vas(II)-ionok és aszkorbinsav (előnyösen L-aszkorbinsav) jelenlétében játszatjuk le. A kémhatástól függően az aszkorbinsav aszkorbát alakjában is lehet. Ezek a kofaktorok fokozzák az enzim aktivitását. Az enzim aktivitásához minimális vas(lI)-ionra van szükség. A vas(lI)-ion koncentrációja általában 50 /«M és 0,2 mM között van. Minél tisztább az enzim, annál kisebb mennyiségű vas(II)-ionra van szükség a maximális aktivitás eléréséhez. A vas(lI)-ionnal együtt alkalmazott L-aszkorbinsavból az FE2 + koncentrációjával azonos mennyiséget használunk, de alkalmazhatunk ennél magasabb koncentrációt is. A vas(II)-ion forrása különböző sók lehetnek, például vas(II)-szulfát, vas(II)klorid, vas(Il)-karbonát stb. A folyamatot t oxigén jelenlétében végezzük. Kis, laboratóriumi méretnél elegendő oxigénellátottságot biztosít, ha a reakciót nyitott edényben hajtjuk végre. Nagy méreteknél, különösen, ha nagy enzimfelesleget alkalmazunk, az oxigénellátottságot az inkubációs keveréken történő levegő- vagy oxigén-átáramoltatással biztosítjuk. A reakció alatt az inkubációs keveréket jól kevertétjük vagy rázatjuk. A folyamat alatt hidrogén-peroxid keletkezik. Hogy elkerüljük a magas peroxid-szintet, ami káros lehet az enzimre, a szubsztrátra vagy a tér5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
