198916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a kolinerg rendszerre ható tiazol származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
23 HU 198916 B 24 125. példa 2-[ (2-Dietilamino-etil)-amino]-5-nitro-8,9-di-hidro-10H-benzo(6,7)ciklohepta[ l,2-d]tiazol-diklórhidrát (SR 44 411 A) A 118. példában ismertetett eljárással az N-benzoil-N’-[3-(dietil-amino)-propil]-tiokarbamidból és a 2-bróm-8-nitro-benzo-ciklo-heptan-l-onból állítjuk elő a kívánt terméket (diklór-hidrát formájában). Olvadáspont 192-195 °C (izopropanol - 95%-os etanol). A találmány szerint előállított vegyületeknek megvizsgáltuk a farmakológiai tulajdonságait, különös tekintettel a muszkarin-kolinerg receptorokra gyakorolt hatásukra. A vizsgálatokat egyrészt in vitro biokémiai tesztekkel, másrészt állatokon végzett farmakológiai tesztekkel végeztük. In vitro biokémiai vizsgálatok Az emlősöknél a muszkarin-kolinerg receptorok két alosztályát ismerjük, az Mi- és M 2-receptort. Az Mi-tipusú receptorok az agy bizonyos zónáiban, így a hippocampusban, az agykéregben, a striatumban, valamint a szimpatikus ganglionokban találhatók. Ezeket a kapcsolódási helyeket szelektíven lehet jelezni a triciumozott pirenzepinnel (3H-PZ). Az Mz-tipusú receptorok felsősorban a szívben és az ileumban vannak, és triciumozott N-metil-szkopolaminnal (3H-NMS) jelezhetők. A találmány szerint előállított vegyületeknek az Mi és M2 helyekkel szemben mutatott szelektivitásának meghatározására az in vitro kölcsönhatásukat vizsgáltuk a nagyaffinitású 3H-PZ, illetve 3H-NMS kötődési helyekkel, patkány-hippocampus-membránon, illetve tengerimalac ileumja simaizomján. Módszerek A) Az Ml-tipusú muszkarin-kolinerg receptorral szemben mutatott affinitás vizsgálata: A vegyületek és az Mi-típusú muszkarin-receptorok kölcsönhatását in vitro vizsgáljuk, patkány hippocampus-homogenátumban mérve a triciumozott pirenzepin kiszorítását specifikus kötődési helyeiről. 5 tómeg%-os, Na2HP04-pufferral készített (50 mM, pH = 7,40) patkány-hippocampus homogén pép aliquot mennyiségeket (10 ul) 2 órán keresztül 4 °C-on inkubálunk 3H-PZ 281-1010 Bg/mmól, 1 nM végső) és növekvő koncentrációjú vizsgálandó anyag jelenlétében. A végső térfogat 2 ml. A reakciót 10 perces, 50 000 xg centrifugálással állítjuk be. Az üledékek dekantálása és mosása utána kötődött radioaktivitást folyadék-szcintillációval mérjük. A nem specifikus kötődést 10 uM-os atropinszulfát jelenlétében határozzuk meg. Az 50-es gátló koncentrációt (CIso) grafikusan határozzuk meg [Watson, J. D., Roeskoe W. R. és Yamamura H. I.: Life Sei., 31, 2019-2029 (1982)1. B) Az M2-tipusú muszkarin-kolinerg receptorral szemben mutatott affinitás vizsgálata: Az Mz-típusú muszkarin-receptorokkal való kölcsönhatást in vitro vizsgáljuk, tengerimalac ileumja simaizomjéból készített homogén pépen mérve a triciumozott N-metil-szkopolamin kiszorítását specifikus kötődési helyeiről. 0,625 tömeg%-os, 20 mM-os HEPES pufferrel (ez 100 mM NaCl-t és 10 mM MgCl2- -t tartalmazó 2-[4-(2-hidroxi-etil)-piperazin-l-il]-etán-szulfonsav készített tengerimalac - ileum - simaizom homogén pép aliquot mennyiségeket (50 pl) 20 percig 30 °C-on inkubálunk 3H-NMS (314-1010 Bg/mmól, 0,3 nM -■'égső) és növekvő koncentrációjú vizsgálandó anyag jelenlétében. A végső térfogat ' ml. A reakciót 5 perces, 15 000 xg centrifugálással állítjuk le. A nem specifikus kötődést 10 mM-os atropin-szulfát jelenlétében határozzuk meg. [Hammer és munkatársai: hature, 283, 90-92 (1980), Hulme E. C. és munkatársai: Mol. Pharmacol., 14, 737-750 (1978)]. Fredmények A 6. táblázatban tüntejük fel a találmány szerint előállított vegyületek affinitását az Mi- és M2-receptorokhoz. Az eredményeket az 50%-os gátló koncentrációban (CIso) fejezzük ki; ez az a koncentráció (pM-ban), amely a membrán-receptorokhoz kötődő triciumozott ligandum 50%-ának elmozdítását kiváltja. A 3H-PZ kiszorítás CIso-je az Mi-recsptorral szembeni affinitást, a SH-NMS kissorítás CIso-je pedig az M2-receptorral s lemben mutatott aktivitást mutatja. Ezenkívül a táblázat következő oszlopéban feltüntetjük az R arányt az Mi- és az Mz-receptoi’ok CIso-jei között; ez a termékek szelektivitását fejezi ki az egyik receptortíp ássál szemben. Összehasonlításul a 6. táblázatban félti ntettük a 3 összehasonlító mintával kapott eredményeket is. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
