198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
9 HU 198796 B 10 Az 1. példa szerint felületileg aktivált 5x7 cm nagyságú Whatman 540-es papírt reakciós kamrában 7 ml acetonitrilben oldott 2 minél (574 mg) p-amino-benzil-Lrietil-ammónium-bromiddal 12 órán át szobahőmérsékleten reagálhatunk és az 1. példában leírtak szerint fejezzük be a folyamatot. 5. példa 6. példa r — 400 mg kristályos, a 2. példa szerint felületileg aktivált Whatman cellulózt 7 ml acetonitrilben oldott 2 mmól (574 mg) p-amino-berizíl-lrietil-ammóniuin-bromiddnl a 2. példában leírtak szerint reagálhatunk és szintén a 2. példa szerint fejezzük be a folyamatot. 7. példa Az 1. példa szerint felületileg aktivált 5x7 cm nagyságú Whatman 540-es papírt 7 ml acetonitrilben oldott 2 mmól (540 mg) p-amino-benzíl-bromid-hidrobromiddal töltött reaktor edénybe helyezünk és a reakciót 5 ml Irietil-amin hozzáadásával indítjuk. Szobahőmérsékleten, 12 órán át történő kezelés után az 1. példa szerint mossuk és szárítjuk a papírt. 8. példa 400 mg kristályos, a 2. példa szerint felületileg aktivált W'hatiuan cellulózt a 4. példában leírtakkal analóg acetonitrilben oldott 2 mmól (540 mg) p-amino-benzil-bromid-hidrobromiddal reagáltatunk, és a reakció befejezése után mossuk és szárítjuk. 9. példa Az í. példa szerint felületileg aktivált 5x7 cm nagyságú Whatman 540-es papírt reakciós kamrában 7 ml acetonitrilben oldott 2 mmól glicin-(o-nitro-p-metil-trietil-ammónium-bromid)-benzilészterrel 12 órán át szobahőmérsékleten reagáltatunk és az 1. példában leírtak szerint fejezzük be a folyamatot. 10. példa Félszintetikus (poliamid és cellulóz), Hekosyri* Lípusú papírt az 1. példa szerint cianur-kloriddal felületileg aktiválunk és 7 ml acetonitrilben oldoLt 2 mmól (410 mg) 1- -bróni-2-amino-etán-hidrobromidol tartalmazó, üvegből készült reakciós kamrába helyezzük. A reakciót 5 ml Irielil-amin hozzáadásával indítjuk. A reakciós kamrát parafilmmel letömitjük és kb. 12 órán át szobahőmérsékleten rázatjuk. A reakció befejezése után a papirt az 1. példában leirtak szerint mossuk és szárítjuk. 11. példa 4-15 egységből álló lánchosszúségú, különféle oligonukleoUdok manuális szekven tálasa 1. A DNS-sr.ekvénéin radioaktív megjelölése 10 - 50 mmól oligonukleotidet (vagy hosszabb fragmensel) az 5’-végen megjelölünk a szokásos módszerekkel 32P-ATP-vel és polinukleotíd-kínázzal. A kinéz reakció befejeződése után a teljes mennyiséget felvisszük például 20% poli(akril-amid)-gélre, amely adott esetben karbamidot (7M) tartalmaz, és gélelektroforézissel az ATP-tól és más szennyeződésektől, például a nem kívánt melléktermékektől elválasztjuk. A kívánt PNA-szálat rövid autoradiografálással röntgenfilmen láthatóvá tesszük és a gélből kimetsszük. A géldarabot aprítjuk és Eppendorf-kupakba helyezzük. A megjelölt oligonukleotidet 37 - 60 °C közötti hőmérsékleten 30 percig történő kétszeres vizes elúcióval visszanyerjük. 2. A DNS-szék vends megkötése anioncseré- 16 tulajdonságú hordozó lapon Az 1. pont szerint előállított oldatból, amely a megjelölt oligonukleotid mellett adott esetben sókat és karbamidot is tartalmaz, 1- pl-t cseppentünk legalább 4 db, az 1-10. példa szerint előállított, 2 x 2 mm nagyságú hordozó lapra. A papír darabkák szobahőmérsékleten vagy meleg levegővel történő rövid szárítása után a felcsőppentési műveletet addig ismételjük, míg a hordozó lapokon szcintillációs mérőkészülékkel kb. 10000-50000 cpin-l tudunk mérni. A papír darabkákat ezután kétszer vízben és elanolban kimossuk (kb 1-1 percig) és minden mosási művelet uüín itatóspapír közötti rövid nyomkodással szárítjuk. 3. A d(TCTA), a d(TCTAGA), a d(GTGAAUUCAC), a d(TTCTTCTACACACCC) és a d(T-GATCAGATGGCTTT) oiigonukleolidek kémiai modifikációs reakciói reagens-felesleggel reaktor edényben A 2. pont szerint előállított, az egyes oligonukleotid fajtákat, azaz a megkötött, jelzett fragmenseket tarlalamazó 4-4 papír darabkát egyenként egy-egy Eppendorf-kupakba helyezzük. Az Eppendorf-kupakokat megjelöljük az alkalmazott modifikációs reak-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
