198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
5 HU 198796 B 6 x 1 - 2 mm nagyságú hordozó lapot egy-egy speciális reaktorba, például Eppendorf-kupakba vagy automata üvegreaktorba (automatikus betáplálás és elfolyás szabályozással) helyezünk. A hordozó lapot ezután reagens-fölösleggel kezeljük, azaz a hordozó lap úszik a reakciós közegben a reakció ideje alatt. A kővetkező modifikáló reakciókat alkalmazhatjuk: G-reakció DMS-el; A+G-reakció hangyasavval, pjperidin-foriniáttal (pH = 2) vagy dietil-pirokarbonáttal; T+C-reakció kálium-permanganáttal vagy ozmium-tetroxiddal; C-reakció hidroxilaminnal. A reakció befejeződése után vagy eltávolítjuk a hordozó lapot (például csipesszel) a reaktorból, vagy a reagens-felesleget az automata rendszer segítségével leeresztjük. b) Az n fragmenset, amelyet 4 x n db hordozó lapra vittünk fel (rögzítettünk), G-, A+G-, T+C- és C-fragmensekre szétválogatjuk. Az n db G-, az n db A+G-, az n db T+C- és az n db C-reakciót 4 db reaktorban egyidejűleg az a) pont szerint, reagens-fölösleggel végezzük. c) Egy fragmenset 4 db különálló hordozó lapra felvive, vagy n fragmenset 4 x n db különálló hordozó lapra felvive nem reaktorban, hanem kémiailag inert alapon, például üveglapon vagy műanyag fólián, reagens-felesleg nélkül végezzük a négy különböző modifikációs reakciót. Ehhez mikropipettával annyi reagenst viszünk fel a hordozó lapra, amennyi éppen csak megnedvesiti (1-2 mm x 1-2 mm nagyságú anioncserélő tulajdonságú cellulóz papírnál kb. 1 - 5 pl reagens szükséges). d) Az n fragmenset nem 4 x n db 1 - 2 mm2 nagyságú hordozó lapra visszük fel, hanem 4 db geometriailag nagyobb hordozó lapra oly módon, hogy egy-egy hordozó lapra rögzítünk n - n db fragmenset köztük biztonsági távközt hagyva. Az a) vagy a c) pont szerint reagens-fölösleggel vagy anélkül elvégezzük a modifikációs reakciókat ezekkel a hordozó lapokkal. Az a) pont szerinti eljáráshoz a hordozó lapok nagyobb méretének megfelelő reaktorok kellenek, a c) pont szerint eljárva pedig megfelelően nagyobb reagens-térfogatot kell választanunk a nedvesítéshez. A modifikációs reakciók befejeződése után a kémiailag modifikált hordozó lapokat kétszer egymásután gondosan kimossuk vízzel és etanollal. Ez történhet manuálisan, ekkor a hordozó lapokat csipesszel a megfelelő oldószerbe mártjuk, közben pedig itatóspapír közé helyezve nyomkodással szárítjuk. A c) pont szerint adódó nagyobb számú hordozó lapot együLt is moshatjuk, azonban a mosás után azonnal szét kell válogatni azokat. Automatikus rendszerben a modifikáló reagensek leeresztése után üvegszűrővel ellátott reaktorban a hordozó lapokat a víz és etanol folyamatos vagy szakaszos adagolásával mossuk. Végül a csak egy megkötött fragmenset tartalmazó összes hordozó lapot egyenként friss, 10/í-os vizes piperidin oldattal 15 - 45 percen át 90 °C hőmérsékleten kezeljük. Ekkor bekövetkezik a DNG-fonal szakadása és egyidejűleg a hordozó eluálasa. Az n db megkötött fragmenset tartalmazó geometriailag nagyobb hordozó lapokat szét kell vágni úgy, fcfógy egy nagyobb hordozóból n különálló darab keletkezzen. Ezeket egyenként, a fentiek szerint piperidinnel kezeljük. A fragmeriseknek a hordozóból történő eluálása szerves vegyületekkel, ionos anyagokkal vagy elektromágneses sugárzással történik. Az ionos elúcióhoz nagy ionerősségű sókat, például (NfbJHCOa-t, (NH4)2C03-L, [(C2ll5)3NH]zC03-t, (CzlbbNHOOCClb-t, NlbOOCCHa-t, K2HP04-1 és hasonlókat alkalmazunk. A talámány szerinti eljárás előnyei: 1. Az összes kezelési lépésnél nagyon jó mechanikai stabilitást tesz lehetővé. Ez a mechanikai stabilitás és a piperidin-reakcióval kapcsolt kémiai elúció lehetővé teszi a teljes aiitomatizálhatóságot, mivel a teljes folyamatban semmiféle kicsapatási lépés nincs. 2. A hordozó lapok mechanikai stabilitása lehetőséget ad arra is, hogy reagens felesleggel, azaz reaktorban egyidejűleg nagyszámú nukleinsav-fragmensel szekventáljunk. 3. A piperidin-reakció alatti kémia) i elúció alapján elkerülhető az ionos elúció, amely a kicsapatási reakciókat szükségessé tenné és így a rövidebb Tragmensek veszteségéhez vezetne. A találmány szerinti eljárással tehát előnyösen szekventálhatók a rövid DNS/RNS-oligomerek is 4. Lehetséges úgy manuálisan, mint automatikusan nagyszámú, rövid és hosszú nukleinsavfragmens szekvenlálása. A találmány szerinti berendezéssel lehetséges nagyszámú nukleinsavfragmens egyidejű megkötése egy hordozó lapon, lehetséges egyidejű kémiai kezelésük, lehetséges a szilárd fázison megkötött fragmensek elkülönítése a hordozó lap szélvágásával lehetséges további egyidejű kémiai kezelés, valamint egyidejű utókezelések, például mosás, hőkezelés, mélyhűlés és cenlifugúlás. A berendezés a találmány szerint több szekventáló tömbből, a hozzájuk tartozó fedelekből, hordozólap tartókból, valamint mintaadagolóból és szétvágó egységekből áll. A fedél és a hordozó lap tartó valamint a mintaadagoló és a szétvágó egység az alkalmazott jelzések és megvezelések következtében csak egy meghatározott helyzetben építhető össze a szekventáló tömbbel, Így a minták összekeverése kizárt. A szekventáló tömb 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
