198757. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nebramicin komponensek előállítására
7 HU 198757 B 8 szójaliszt 3,0 t% kazein hidrolizátum (enzimatikusan hidrolizált) 0,5 t% ammónium-nitrét 0,1 t% ammónium-k lórid 0,5 t% kalcium-karbonát 0,5 t% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5 L% mono-nátrium-glutamét 0,3 t% kobalt(II)-nitrát-hexahidrát 0,001 t% pálmaolaj és szójaolaj 1 : 1 arányú elegye 3,0 t% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4,4 t% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes ammónium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk be. 37 °C hőmérsékleten fermentálunk, a levegő- 20 térfogat 0,3 levegő tf/téptalaj tf/perc-re állítjuk be, és percenként 125-öt forduló keverővei kevertetünk. Fermentáció közben mérjük a szénforrás fogyását, az ammónia-nitrogén alakulását és a biológiai aktivitást. Bioautográfiás vékonyréteg kromatográfiás módszerrel vizsgáljuk a termelt antibiotikum-komplex faktorösszetételét. A szilikagél (Merck, Darmstadt) vékonyrétegre 0,1-0,5 Mg/ml közötti mennyiségű an- 5 tibiotikumot cseppentünk, majd futtatóelegyként etil-alkohol, metil-etil-keton és 25%-os ammónium-hidroxid 1:1:1 arányú elegyét használva kromatografálunk. A réteg teljes száradása után Bacillus subtilis ATCC-6633 10 mikroorganizmust tartalmazó agartáptalajt rétegesünk a lemez felületére, és 37 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. Ezután standarddal összehasonlítva meghatározzuk a gáLlási zónák nagyságát. A mérés mennyiségi 15 és minőségi kiértékelésre alkalmas, pontossága ±10%. Az antibiotikum termelés 140 órás korra éri el a maximumot. Ekkor a tenyészet literenként 3,4 g nebramicin-2-t, 0,75 g nebraniicin-4-et és 1,3 g nebramicin-5’-t tartalmaz. A fermentlé aliquot részét (3 liter) a 174.315 számú magyar szabadalmi leirés 1. és 2- példái szerint dolgoztuk fel. 25 A kinyert termékek minőségi jellemzői: E4'ícb<295 nm) Biológiai hatóérték(jug/mg) Apramicin-szulfát 6"-0-karbamoil-kanamicin B bázis 6"-0-ka>’hamoil-tobramicin bázis 0,510 0,215 0,235 540 615 970 Apramicin azonosítási és tisztasági vizsgálata VRK-ban: Rf értéke megegyezik az összeha- 35 sonlitó (standard) anyag Rf értékével, egyéb szennyezések: 6-7%. 6"-0-karbamoil-kanamicin B bázis: [oC]“d = +128°; op: 178-181 °C (bomlik) 6"-0-karbamoil-tobramicin bázis: 4® [oC^d = +148°; kémiai hatóanyagtartalom (potenciometrikusan): 99,2% 2. példa 45 a.) Az 1. példában leírtak szerint készült inokulum 50 1-ével beoltunk 700 1 saválló acél fermentorban 60 percen át sterilezett csapvízzel készült 'alábbi összetételű fő- 50 fermentációs táptalajt: szójaliszt kazein hidrolizátum (enzimatikusan hid-3,5 t% rolizélt) 0,5 t% ammónium-nitrát 0,1 t% ammónium-klorid 0,5 t% kalcium-karbonát magnézium-szulfát-0,5 t%-heptahidrát kobalt! II )-nitrát-1,0 t% hexahidrát mangán-szulfát-hep-0,001 t% tahidrát 6 0,15 i t% mono-nátrium-glu tárnát 1,0 t% pélmaolaj és szójaolaj 1 : 1 arányú elegye 3,2 t% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4,4 t% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes ammónium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk be. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük. A fermentor keverőjének percenkénti fordulatszámát 125-re állítjuk be. A levegőztetési arány 0,1 levegötérfogat/táptalajtérfogat/perc. A 140 órás fermentlé literenként 2,98 g nebramicin-2-t, 0,171 g nebramicin-4-et és 2,68 g nebramicin-5’-t tartalmaz. b.) Az a.) pontban leirt táptalajt oltva azzal azonosan végezzük a fermentációt, azzal a különbséggel, hogy a levegőztetés arányát 1 levegő tf/táptalaj tf/percre állítjuk be a fermentáció teljes időtartamára. Így a nebramicin-4 bioszintézise lényegesen megemelkedik. A 140 órás tenyészet literenként 3,45 g nebramicin-2-t 1,34 g nebramicin-4-et és 1,13 g nebramicin-5’-t tartalmaz. A kinyert anyagok minőségi paraméterei megegyeztek az 1. példában megadott értékekkel.
