198741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citorodin S származékok, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 198741 B 10 reakcióelegyet 20 ml lehűtött 0,5%-os vizes ecetsav-oldatba öntöttük, és az elegyet kétszer 5 ml diklór-meténnal extrahéltuk az el nem reagált citorodin S eltávolítására. A kapott vizes ecetsavas oldat pH-ját telített vizes nétrium-hidrogén-karbonát-oldattal 8-ra állítottuk be. A vizes oldatot háromszor 20 ml diklór-metánnal extraháltuk, az aminoszármazék elválasztására. A diklór-meténos fázist vízmentes nátrium-szulfáton megszárítottuk és a diklór-metánt vákuumban ledesztilláltuk. Így 4,8 mg citorodin S amino-származékot kaptunk, amelyet a továbbiakban amino-citorodin S-ként emlitünk. A termék tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográf iával (HPLC) ellenőriztük. A körülmények a következők: SSC-Aquasil PE-2, 4,6 mm x 250 mm oszlop (Senshu Kagaku gyártmány); oldószer: 75% 2,0%-os trietil-ammónium-foszfát (pH=3), 25% acetonitril; retenciós idő citorodin S: 25,0 perc, aminocitorodín S: 12,9 perc. A HPLC-vel kapott citorodin S származék tömegszámét FAB/MS spektrométerrel (Nihon Denshi JMS-DX300) mértük meg, 942 (M+H*) tömegspektrumot kaptunk, amely megegyezik a számítottal. A származék abszorpciós spektrumában specifikus abszorpció volt megfigyelhető 495 nm-né), ami a citorodin S antraciklin gyűrűjének tulajdonítható. Ez ugyanolyan spektrummal rendelkezik, mint a kiindulási citorodin S, ami azt mutatja, hogy a származék rákellenes aktivitása nem veszett el. 2. példa 2 ml diklór-metánban feloldottunk 4.8 mg, az 1. példa szerint előállított amino-citorodin S-t. Az oldathoz hozzáadtuk 3.8 mg N-í-maleimido-butiril-oxi-szukcinimid (Behring Diagnostics gyártmány, a továbbiakban GMBS-ként említjük) 10 mg/ml-es diklór-metános oldatát, amely az amino-citorodin S 5 mólegyenértékének felel meg. A reakcióelegyet 25 °C-on 2 óra hosszat reagál tattuk. A reakcióelegyet ezután preparativ vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) tisztítottuk, és citorodin S GMBS-származékét nyertük ki. A vékonyréteg-kromatográfia körülményei: vékonyréteg lemez, 2 mm szilikagél 60F-254 (Merck gyártmány); kifejlesztő oldószer metanol és diklór-metán 1:4 térfogatarányú elegye; Rf-érték, GMBS-származék: 0,82, amino-citorodin S: 0,29. Az így előállított GMBS származékot extraháltuk a vékonyréteg-lemezről, az extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton megszárítottuk, az oldószert vákuumban ledesztilláltuk. így 2,7 mg citorodin S GMBS-származékot kaptunk. A GMBS-származék tisztaságát HPLC-vel vizsgáltuk, és tisztítottuk. Az elemzéshez alkalmazott feltételek: 4,6 mm x 250 mm méretű SSC-Aquasil PE-2 (Senshu Kagaku) oszlop; oldószer: acetonitrilt adagoltunk 2,0%-os trietil-ammónium-foszfátban (TEAP, pH=3,0) 30 perc alatt 0%-30% lineáris gradiensnek megfelelően, majd a 30% acetonitril adagolását végeztük 30 percig; étfolyási arány 1 ml/perc; retenciós idő, citorodin S: 36 perc, GMBS származék: 38 és 38,6 perc. A tisztításhoz alkalmazott feltételek: 10 mm x x 250 mm méretű Senshu Pak NP-318-4252 oszlop (Senshu Kagaku); oldószer: acetonitrilt adagoltunk 2,0%-os TEAP-ban (pH=3,0) 20 percig 10%-30% lineáris gradiensnek megfelelően, majd a 30%-os acetonitril adagolást folytattuk további 15 percig. Hasonlóképpen 5 perc alatt változtattunk a 30%-100% gradiensnek megfelelően; átfolyási arány: 4 ml//perc; retenciós idő, GMBS-származék: 28 és 28.5 perc. A HPLC eluátumát SEP-PAK (Cis) töltetre vittük fel (Nihon Waters gyártmány), ahol adszorbeáltattuk a citorodin S származékot, majd 0,5%-os vizes ecetsav-oldattal mostuk, és 0,5%-os metanolos ecetsav-oldattal eluáltuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson megszárítottuk, és így kb, 3,2 mg GMBS-származékot kaptunk. A termék tisztaságát HPLC-vel a fenti körülmények között vizsgáltuk. A HPLC-vel kapott citorodin S származék tömegszámát FAB/MS spektrométerrel (Nihon Denshi gyártmány, JMS-DX300) mórlük, 1215 (M+H*) tömegspektrumot kaptunk, mely megfelel a számítottnak, azaz a tömegspektrum mérésében alkalmazott tioglicerinnel alkotott komplex tömegszámúnak. A származék abszorpciós spektruma megtartotta az antraciklin gyűrű specifikus abszorpcióját 495 nm körül. Emellett a maleimidocsoport bevezetését megerősítette az, hogy az aminoetán-tiollal végzett reakcióval megváltoztak a foltok és csúcsok helyei a TLC-ben és a HPLC-ben. Az elemzésre használt feltételek a HPLC-ben ugyanazok, mint fent. Retenciós idő, amino-citorodin S: 19,5 és 20,5 perc, GBMS-szát— mazék és amino-etán-tiol adduktum: 23 és 23.5 perc. (Kontroll kísérletként a kiindulási amino-citorodin S és amino-etán-tiol elegyét, amelyet ugyanolyan körülmények között készítettünk, mint a GMBS-származékkal, reagáltattuk. Úgy találtuk, hogy az amino-citorodin S HPLC-csúcsait nem érintette a tiol beépítése). 3. példa 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 1 ml 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldatban (pH=7,5) feloldottunk 18 mg nyúl immunoglobulint (Sigma gyártmány). Az oldathoz hozzáadtunk 10 yl 100 mmól/l-es dimetil-formamidos N-szukcinímidil-S-acetil-tioacetát-oldatot (Behring Diagnostics gyártmány, a továbbiakban SATA), és az elegyet 25 °C-on 20 percig reagáltattuk. A reakcióelegyhez hozzáadtunk 50 yl 1 mól/l-es trisz-hidrokloridot (pH=7,8), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
