198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 műveletet végzünk. Redukálás céljából a rezorufint vagy a rezazurint 10 perctől 1 óráig terjedő időn át 2 —10 ekvivalens — előnyösen 2-6 ekvivalens — ón(II)-kloriddal melegítjük 5-25%-os vizes sósavoldatban. A dihidrovegyület lehűléskor kiválik. Az acetilezést a szokásos módon ecetsavanhidriddel valósítjuk meg. Az (V) általános képletű vegyüleleket előnyösen úgynevezett "egyedényes” eljárással megvalósított reduktív acetilezéssel állítjuk elő. A megfelelő rezorufint vagy rezazurint 2 — 6 ekvivalens mennyiségű ón(II)-kloriddal 5 perc —5 óra — előnyösen 10 perc — 3 óra — hosszait ecetsavanhidridben forraljuk visszafolyatás közben, de úgy is eljárhatunk, hogy a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4—16 órán át keverjük. A (II) általános képletű rezorufin-származékok glikozidjainak szintézise során nemfluoreszkáló vegyülelek keletkeznek, melyekből a megfelelő glikozidázokkal végzett enzimatikus hasítással a fluoreszkáló rezorufin-származékok ismét felszabadíthatok. A találmány szerinti fluorogén rezorufinszármazékok az eddig ismert glikozidokhoz képest másfajta kromogén, illetve fluorogén csoportokat tartalmaznak és igen előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek. így a monoszubsztituált származékok az enzimatikus hidrolízis során olyan kinetikát mutatnak, amely igen egyszerűen leírható a Miehaelis-Merten-összefüggés segítségével. A rezorufin-/?-D-ga!aklopiranozid például Kjvi= 0,38 mmól/liter Michaeliskonstans értéket ad. Ezen hidrolízis gátlása a természetes szubsztrátum laktózzal kompetitiv jellegű. így a rezorufin-származékok glikozidjainak specifikus átalakulását bizonyos vizsgálatok számára természetes glikozidok — a fl-D-galaktozidáz esetében laktóz — hozzáadásával definiálni és reverzibilisen módosítani lehet. A rezorufin-származékok találmány szerinti glikozidjai vizes oldalban + 4 °C hőmérsékleten gyakorlatilag korlátlan ideig eltarthatók. A rezorufin-alapváz glikozidjainak oldhatósága a legtöbb kinetikus vizsgálat céljaira már elegendő, a megfelelő glikozid oldhatóságát azonban lényegesen javítani lehet karbonsav-észter-csoport, poláris csoportokkal rendelkező karbonsav-származékok, illetőleg szulfonsav-csoportok bevitelével. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek gerjesztése és emissziója a látható spektrumtartományban van és a kvantumkihasználás kielégítő. A rezorufin maximális fluoreszcenciaintenzitását pH = 7,0 érték felett érjük el és alacsonyabb pH-érték esetén ez csak lassan csökken. Vizes oldatban a rezorufin-glikozidok legtöbbször sárga színűek (Amax kb. 470 nm-nél). Az enzimatikus reakció után kapott termékek színe többnyire vörös (Amax kb. 570 nm-nél), úgy hogy az anyagok fotometriás meghatározásokhoz és műszerek alkalmazása nélküli vizuális eljárásokhoz is kiválóan alkalmasak. A találmány további tárgya a rezorufin-származékok (I) általános képletű új glikozidjainak alkalmazása a megfelelő glikozidázok, mint például az a-D- és a /9-D-galaktozidáz, az a-D- és a /?-D-glükozidáz, valamint az a-D-mannozidáz aktivitásának meghatározásához. Azokat az (I) általános képletű rezorufinszármazékokat, melyekben a glikozidcsoport egy oligoszacharid-lánc, még a szacharidláncot hasítani képes enzimek kimutatására is igen előnyösen alkalmazhatjuk. Ennek során a vizsgálandó enzim karakterisztikusan hasítja az oligoszacharid-láncot, amit előnyösen a monoszacharid-fokozatig történő hasítást jelent. Szükséges esetben további segédenzimeket is alkalmazhatunk. A monoszacharid-fokozatig lebontott glikozidot azután az előbbiekben leírt módon a megfelelő glikozidázzal — pl. alfa és/vagy béta-glikozidázzal — rezorufin-alapvázra és monoszacharidra hasítjuk. A találmány tárgyához tartoznak továbbá a glikozidázok aktivitásának meghatározására szolgáló diagnosztikai készítmények, melyek valamilyen (I) általános képletű új rezorufinglikozidol tartalmaznak. A rezorufin-származékok (I) általános képletű glikozidjainak alkalmazása glikozidázok szubsztrátumaként azt eredményezi, hogy a vizsgálati rendszer az eddigi ismeretekhez képest jelentős mértékben érzékenyebbé válik. Az új szubsztrátumokat glikozidázok aktivitásának meghatározására igen előnyösen alkalmazhatjuk mind a biokémia és a biotechnológia, mind a klinikai kémia szakterületein. A nagyobb érzékenység az alább felsorolt előnyöket biztosítja: a) alacsonyabb enzimaktivitások is meghatározhatók, b) kisebb mintamennyiséget alkalmazhatunk, c) az aktivitás meghatározását lényegesen rövidebb idő alatt el lehet végezni, d) a kisebb mintamennyiség és a kedvező mérési hullámhossz folytán csökken a módszernek a próbában levő többi anyag által okozott zavarokra való hajlama, e) hordozómátrixokban levő immobilizált enzimek aktivitását is meg lehet határozni. Kimutattuk, hogy a találmány egyik tárgyát képező szubsztrátumok bármilyen eredetű glikozidázok aktivitásának meghatározására alkalmasak. A találmány szerinti diagnosztikai készítmények, melyek valamilyen (I) általános képletű szubsztrátumot tartalmaznak, kifejezetten érzékenyebben reagálnak, mint az ilyen célra eddig ismert készítmények. A rezorufin-származékok (I) általános képletű új glikozidjai olyan immunológiai meghatározásokra szolgáló módszerekhez is alkalmasak, melyeknél a glikozidázokat indikátorenzimként használják és az aktivitást az immunológiai reakció lefolytatása után kell meghatározni. Az ilyen enzimatikus indikálással végzett immunológiai meghatározási módszerek a szakemberek előtt "enzimimmunoassay" elnevezéssel ismertek. Ezek a módszerek a 10"5 —10'12 mól/liter tartományon belül proteinek, poliszacharidok, hormonok, gyógyszerhatóanyagok és másféle alacsony molekulatömegű anyagok koncentrációjának meghatározására szolgálnak. A fáziselválasztó lépésekkel szembeni követelmények sze-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
