198514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek renaturálására
1 2 A,találmány tárgya új eljárás proteinek renaturá- 1 ás ára. A jelen találmány keretén belül proteinek renaturálása alatt proteinek normális biológiai működésének helyreállítását vagy újbóli helyreállítását értjük, melynek során feltételeztük, hogy a természetes szekunder, tercier és adott esetben kvatemer struktúra is újból helyreállítódik. A proteinek renaturálásának a problémája nagy jelentőséggel bír, mivel a biológiailag aktív proteinek az előforduló kezelések során, például a kísérő anya-Sokból való elválasztásukkor sokféleképp denaturá- Sdnak, és ekkor az illető biológiai aktivitást egészen vagy részben elvesztik. A renaturálás szintetikus vagy a géntechnológia módszerei szerint előállított proteinek esetében is jelentőséghez jut, mivel ilyenkor sok esetben csak a helyes primer struktúrát, tehát az aminosavszekvenciát kapjuk meg, a biológiai aktivitás kí"ánt felhasználása azonban feltételezi, hogy a természetes szekunder struktúra, tercier struktúra és adott esetben a kvatemer struktúra kiépülése közben megy végbe a renaturálás. A 4.530.787. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból már ismert, hogy olyan szintetikus proteineket, amelyek redukált dszteint tartalmaznak, jodozil-benzoáttal biológiai aktivitásuk visszanyerése közben oxidálnak. Mégha ez a módszer általánosan alkalmazható is lenne, a proteinek renaturálásának akkor is csak egy részproblémáját oldaná meg. G. Zettlsmeissl, R. Rudolph és R. Jaenicke [Biochemistry, 18, 5567-75 (1979)] egy oligomer enzim, nevezetesen a laktát-dehidrogenáz renaturálását tanulmányozták tercier struktúrájának újbóli visszaállítása közben, és megállapították, hogy ilyen renaturálás közben két konkurráló reakció megy végbe, egyrészt a renaturálódás, másrészt pedig inaktív aggregátumok képződése. Jó renaturálódási hozamok elérése céljából arra kell vigyázni, hogy az oldatban né lépjük túl az enzimek egy határkoncentrációját. Proteinek renaturálására szolgáló általános eljárás azonban ebből sem vezethető le. A találmány feládata ezért olyan eljárás biztosítása, amely általánosan lehetővé teszi proteinek renaturálásának javítását. A jelen találmány szerint ezt a feladatot denaturált proteineknek egy renaturáló puffer-oldatában történő renaturálására szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelyre az jellemző, hogy a renaturálandó proteinnek a kiválasztott pufferban egy kritikus koncentrációjú oldatát készítjük el, és hajtogatott intermedier képződése után további renaturálandó proteint adunk hozzá a kritikus koncentráció eléréséhez szükséges mennyiségben. Az eljárás azon a felismerésen alapul, hogy a renaturált proteinre számítva lehető legmagasabb kitermelés a renaturálás egyidejű maximális sebessége mellett akkor érhető el, ha az oldatban a denaturált renaturálandó proteinnek egy bizonyos kritikus koncentrációját nem lépjük túl, ahol ez az érték az illető protein fajtájától és azoktól a körülményektől függ, amelyek között a renaturálást végrehajtjuk. Eközben fontos, hogy a két egymással konkuráló reakciót, mégpedig egyrészt az inaktív proteinek (például aggregátumok) nemkívánatos képződését, másrészt pedig egy olyan hajtogatott intermedier képződését; amely végeredményben a végleges natív renaturált proteinné alakul át, úgy toljuk el, hogy csak a lehető legkisebb arányban keletkezzen inaktív protein. Ehhez az szükséges, hogy figyelembe vegyük a renaturálandó protein proteinspecifikus és feltételspedfikus kritikus koncentrációját, a hajtogatott intermedier renaturálódási kinetikáját és a képződéshez szükséges időt.. [R. L. Baldwin, Intermediates in Protein Folding Reactions and the Mechanism of Protein Folding, Annual Review os Biochemistry 44 (1975) 453-475 és P. S. Kim and R. L. Baldwin, Specific Intermediates in the Folding Reactions of small Proteins and the Mechanism of Protein Folding, Annual Review of Biochemistry 51 (1982)459-4871. Ez a három, az eljárás szempontjából lényeges paraméter minden további nélkül meghatározható. A kritikus koncentráció egy olyan mérőgörbe segítségével állapítható meg, amelyet úgy kapunk, hogy a mindenkori kiválasztott renaturáló pufferhoz különböző koncentrációknak megfelelő denaturált proteint adunk, és egy előre megadott időtartam után mérjük a renaturált protein elért végkitermelését. A kritikus koncentráció annak az értéknek felel meg, amelynél a natív renaturált proteinre nézve a legmagasabb kitermelést kapjuk. Itt a találmány keretén belül a legmagasabb koncentráció mintegy 10%-ának megfelelő koncentráció jön ,.kritikus koncentrációként' számításba. A renaturálódási kinetika ugyancsak ismert módszerek szerint meghatározható. Itt a maximálisan lehetséges koncentrációnál a renaturált proteinné való átalakuláshoz szükséges időt határozzuk meg. A hajtogatott intermedier képződéséig eltelő idő végül egy egész sor különböző eljárással meghatároz.ható. Az egyik első meghatározási módszer a drkijlárdikroizmus (CD) mérése. Ennél célszerűen olyan hullámhosszat választunk, ahol nagy jelet kapunk, és utána kimérjük a megfelelő görbét, ahol rendszerint meredek emelkedés megy végbe viszonylag rövid időn belül, és a görbe utána ellaposodik, amint a hajtogatott intermedier képződött. További lehetőséget jelent az, hogy kövessük a szulfhidrilcsoportok intramolekuláris diszulfidhidak képződése során történő eltűnését. Ennek során, azonban vigyázni kell arra, hogy nem szabad intermolekuláris diszulfidhidakat képezni, ami a molekulasúly ellenőrzésével figyelhető, amely utóbbi esetben növekedne. Egy még további lehetőséget nyújt a fluoreszcendamérés. Ez a triptofán-, illetve tirozin-fluoreszcendán alapul, ami megváltozik, ha az aromás gyökök az összehajtogatódó protein egy hidrofób régiójába kerülnek át. További lehetőségek a korlátozott proteolízisek, mivel a hajtogatott intermedier fokozódó képződésével a proteolitikus támadás lehetősége is csökken. Az is lehetséges, hogy ezt a meghatározást hidrodinamikus mérésekkel hajtsuk végre. Például a belső viszkontást mérjük, amely csökken, mivel a hajtogatott intermedier kisebb viszkozitású oldat keletkezéséhez vezet. A gyakorlatban elegendő a kritikus koncentrádót és az inaktív proteinek felé menő mellékreakdó ellen védett hajtogatott intermedier képződéséig eltelő időt kimérni, és mindenkor a kritikus koncentrádóval kezdeni, és a hajtogatott intermedier képződésének végbemenetele után újból a közbülső időben 198.514 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
