198510. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nor-kolánsav származékok és hatóanyagként ezen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 2 Közelítőleg 1 1,8 x 109 ml mosott eritrocitát 130 ifi mól [1 NaCl-ot, 1 mmól/1 MgCl2-ot, 10 mmól/1 glükózt. 10 mmól/1 szacharózt. 10 mmól/1 Tris/HG-puffert (pH 7,4), 2 x 10'9 mól/1 3H-ouabaint és növekvő koncentrációban jelzetlen aminoglükozid-szteroidokat tartalmazó elegyben 37 °C-on 5 órán keresztül inkubálunk. A kötött ouabain mennyiségét gyors szűréses módszerrel (Whatman G/C üvegszűrő membránon) határozzuk meg. amellyel elválasztjuk a szabad ouabaint a membránhoz kötöttől. A szűrőn maradt radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval határozzuk meg. A 10‘3 mól/1 jelzetlen ouabain jelenlétében mért kötődést tekintjük nemspecifikus kötő-, désnek. A disszociádós állandót (Kq értéket) a jelzetlen aminoglükozid-szteroidok azon koncentrádójából számítjuk ki, amely 50%-kal gátolja a 3H-ouabain kötődést egyensúlyi helyzetben, Erdman és munkatársai [Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 283. 335 (1973)] módszere szerint. Az (1) általános képletű vegyületek a fenti vizsgálatban hatásosak, Kqértékük 10’9 és lO"5 közötti. c) (Na^-K^-ATP-áz által médiáit Na^-kiáramlás gátlása emberi vörösvértestekben A vizsgálatot Garay és munkatársai [Biochem. Pharmacol. 33, 2013—2020 (1984)] módszere szerint végezzük. A vörösvértesteket 20- 25%-os hematokrit-értékben 74 mmól/1 MgG2-ot, 2 mmól/1 KG-ot, 84 mmól/1 szacharózt, 10 mmól/1 MOPS/Tris-puffert (pH 7,4 37 °C-on) és 10 mmól/1 glükózt tartalmazó elegyben szuszpendáljuk. A vörösvértest-szuszpenziót hidegen Mg2*-szacharóz-K4 közeget és növekvő koncentrációban ouabaint, és állandó koncentrádóban aminoglükozid-szteroidot tartalmazó csövekbe mérjük. A csöveket 37 °C-on inkubáljuk, és különböző időpontokban (0., 10., 20., 30. percben) alikvotokat veszünk a szuszpenzióból és hidegen centrifugáljuk. A felülúszóban atomabszorpdós módszerrel mérjük a külső Na*-koncentráriót. Elvégezzük az ouabain-függő Na4-kiáramlás gátlásának kinetikai analízisét a különböző aminoglükozid-szteroid-koncentrádók függvényében, és minden egyes vegyidet esetén kiszámítjuk az 1C50-értéket. A fenti vizsgálat szerint az (1) általános képletű vegyületek 10'5' és 10’6 mól/1 közötti koncentrádó-tartományban hatásosak. (1) általános képletű aminoglükozid-szteroidok vérnyomáscsökkentő hatásának vizsgálata in vivo A szisztolés vérnyomás indirekt meghatározását csoportonként négy spontán hipertenzív, 8—10 hetes patkányon (SHR, Kyoto, szállítja: Charles River, Olaszország) végezzük. Az állatokat 36 °C-os környezetben tartjuk 10- - 15 percen keresztül, és feljegyezzük a pulzus-nyomást, majd mérjük a szisztolés vérnyomást és a szívverést, közvetett farok-mandzsetta-módszerrel, W+W BP rekordert (Model 8005) alkalmazva. A vizsgálandó vegyületeket orálisan adagoljuk, 5%-os gumiarábikum-oldatban szuszpendálva, naponta egy alkalommal, négy egymást követő napon keresztül, és a méréseket a kezelés előtt, és a kezelés után 1, illetve 5 órával végezzük, a kezelés első és negyedik napján. A kontroll állatok csak hordozóanyagot kapnak (0,2 ml/100 g testtömeg). A vizsgálandó vegyidet hatását a szisztolés vérnyomásra a kezelés előtti és utáni értékek különbségéből számítjuk ki. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények szilárd készítmények — például tabletták, kapszulák és porok - vagy cseppfolyós készítmények — például elixírek, szirupok és szuszpenziók - lehetnek, orális alkalmazás esetén. Az (1) általános képletű hatóanyagokból injekdókat vagy kúpokat is készíthetünk. A hordozóanyag vagy hígítóanyag a találmány szerint előállított készítményekben például poiszerű szilárd anyag, például laktóz, szacharóz, dextróz, mannit, szorbit, cellulóz és glidn, vagy egyéb hasonló anyag lehet. A készítmények ezenkívül tartalmazhatnak csúsztatóanyagot, kötőanyagot vagy dezintegrálószert is. Csúsztatóanyagként például szilícium-dioxidot, talkumot, magnézi um-sztearátot és polietilénglikolt használhatunk. A kötőanyag például keményítő, tragantgyanta, zselatin, metil-cellulóz és poli(vinil-pirrolidon) lehet. Dezintegrálószerként megfelel például a keményítő és az agar stb. A találmányt közelebbről a korlátozás szándéka nélkül az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni 1. példa 3-[(3-Amino-3-dczoxi-/3-D-glükopiranozil)-oxi]-14,21 -dihidroxl-(3/3,5/3.14/3,20R)-24-nor-kolánsav előállítása 376 mg 3,14,21-trihidroxi-(3/3,5/3,140,20R)-24-nor-kolánsav-laktont 100 ml vízmentes benzolban oldunk, hozzáadunk 3,4 g Fetizon-reagenst, és az elegyhez azeotrópos desztillálás és visszafolyató hűtő alatti forralás közben, 3 óra alatt cseppenként hozzáadjuk 928 mg 3-dezoxi-2,4,6-tri(0 acetil)-3-(trifluor-acetamidoj-a-D-glükopiranozil-brotnid 100 ml vízmentes benzollal készült oldatát. Az elegyet szobahőmérsékletre hűtjük, szűrjük, a szerves fázist telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és szárazra pároljuk. A nyers maradékot szilikagélen kromatografáljuk, az eluálást ciklohexán és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyével végezzük. 531 mg 3-S[3-dezoxi-2,4,6-tri(0-acetil)-3- -(trifluor-acetamido)-ft-D-glükopiranozil]-oxi] -14,21- -dihidroxi-(3/3,5/3,14/3,20R)-24-nor-kolánsav-laktont kapunk. A fenti védett glükozid 531 mg-ját 28 ml 0,1 n 1:1 térfogatarányű metanol-víz eleggyel készült kálium-hidroxid-oldatban oldjuk. Az oldatot 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd szárazra pároljuk, a maradékot vízben oldjuk és ecetsavval pH 5-re savanyítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. 300 mg cím szerinti vegyületet kapunk. 2. példa 3-[(3-Amino-3-dezoxi-0-D-glükopiranozil)-oxi]-14,21-dihidroxí (30,50,140,2OR)-24-nor-kolánsav-lakton előállítása 198.510 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
