198443. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új rezorcin-éterek előállítására
1 2 198.443 áris regressziós analízis segítségével meghatározzuk. Tengerinialacokon végzett brpnchokonstrikdós teszt (in vivő, aeroszolos alkalmazás) 400- 700 g testtömegű hím tengerimalacokat intraperitoneálisan bevitt 1,4 g/kg uretánnal elaltatva érzéstelenítünk, majd az állatok nyaki vénájába (vena jugularis) egy polietilénből készült kanült vezetünk be. Egy másik polietilén-kan ült az állatok légcsövébe vezetünk. Az állatok nyelőcsövében levő nyomást a nyelőcsőbe bevezetett és egy „Statham-Druck-Transduktor” ral összekötött kanül segítségével regisztráljuk. A kísérleti állatot plexiüvegből készült, légmentesen zárható kamrába helyezzük el, a kamra egy 000 számú Fleisch-csővel össze van kötve egy Validyne-Transducer MP44—1 készülékkel. Az ismertetett elrendezéssel a légzés áramlási jellemzői mérhetők. A kísérleti állatok ilyen sebészeti előkészítése után várunk egy ideig, ezalatt a pulmonális funkciók stabilizálódnak. Ezt követően a vizsgálni kívánt vegyületet az alábbi előírásoknak megfelelően beadjuk: A kísérleti állatokat egy percig a vizsgálni kívánt vegyületből készített 1%-os aeroszololdat (tömeg/ /térfogat%), illetve desztillált vizes aeroszol hatásának tesszük ki, az utóbbi kontrollként szolgál. Az inhaládós úton beadott kísérleti vegyületek diszpergálásánál egy . Monaghan-Ultraschall-Spühgcrat Modell 670” készüléket alkalmazunk, ezzel 1 és 8 mikron közötti — főtömegében 3 mikron körüli — részecskeméretű aeroszolt kapunk. A vizes oldatokat mindig frissen készítjük és azokat egy „on-stream drug "vial” segítségével az említett készülék kamrájába vezetjük. A kapott ködpermetet egy 65 ml térfogatú üvegkamrán keresztül vezetve az állatok légcsövébe bevezetett kanülön át juttatjuk be a szervezetbe. A kezelési idő elteltével két percen át egy másik „Monaghan-Ultraschall-Sprühgerat Modell 670” készülékben előállított és a fentiekkel azonos üvegkamrán át bevezetett LTD4- -aeroszolt adunk be az állatoknak (0,3 pl/ml). Az LTD4 alkalmazását követő 3. percben leolvassuk a kompliansz csökkenését és három kezelt állatnál kapott középértéket három kontroll állatnál kapott középértékkel hasonlítunk össze. Ezekből a komp liansz százalékos gátlását az alábbi képlettel számítjuk ki: Gátlás %-a = 100-(100 - készítmény-kompliansz) . 100 (1Ö0 - konUoIl-kompliansz) Amennyiben a fenti kísérletekben az egyes hatóanyagokat többféle, egymástól különböző koncentrációban alkalmazzuk, úgy a százalékban kifejezett gátlást minden egyes koncentrációra nézve feljegyezzük, majd egy koordináta-rendszer abszcisszájára logaritmikus léptékben a koncentrációt, az OTdinátára a megfelelő gátlási százalékot felvisszük, végül az IC50- -értéket lineáris regressziós analízissel meghatározzuk. Ebben az utóbbi kísérleti elrendezésben például az N- (3-[3-(4-acetjl-3-hidroxi-2-n-propiI-fenoxi}propil-oxifó-metil-fenilj -oxaminsav-trietanol-ammóniumsójára ICjo-értékűnek a 0,024%-os aeroszololdat, míg az N-{3-(3-(4-acetil-3-hidroxí-2-n-propil-fenoxi)-prop-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 il-cxi]4-bróm-6-metil-fenil} -oxaminsav-trietil-ammó- ■ niumsójára 1CS0-értékűnek a 0,035%-os aeroszololdat bizonyult. Emberi leukoritákból nyert foszfolipáz A* gátlásának meghatározása (in vitro teszt) ,Buffy coats”-ból kiindulva többfokozatú frakdonált szedimentádóval neutrofil, polimorf magvű, emberi eredetű leukocitákat izolálunk és azokat mélyhűtéssel fagyasztjuk. A foszfolipáz Aa-t a sejtek szuszpenziójábói állítjuk elő olymódon, hogy azokat 2 mólos nátrium-klorid-oldatban - jéghideg 0,36 n kénsav hozzátétele mellett - homogenizáljuk, majd 10.000 g-vel végzett centrifugálás után kapott maradékot 4,5 pH-jú nátrium-acetát-pufferrel szemben dializáljuk. Az enzimaktivitás meghatározására az enzimet (10 -30 pg protein) 0,1 mólos 7 pH-jú trisz/HG-pufferben 1 mmól kaldum klorid és szubsztrátum hozzátétele mellett 37 °C-on 1 óra hosszat inkubáljuk. A szubsztrátum Escherichia coli ból bioszintetikusán kapott és 14C-olajsawal radioaktívan jelzett foszfolipidekből áll (2 pmól). lnkubálás után a reakciót Dole-reagens [izopropanol-heptán—1 n kénsav, térfogat szerint 40:10:1] hozzáadásával megállítjuk és a foszfolipáz Aj által szelektíven felszabadított l4C-olajsavat extraháljuk. Az ezzel együtt extrahált szubsztrítumot teljesen eltávolítjuk olymódon, hogy a kivonatot egy szilikagél-oszlopon keresztül szűrjük. Az eluátumban levő 14 C-olajsavat radiometrikusán határozzuk meg. A vizsgálandó vegyületeknek a foszfolipáz Aj -re kifejtett gátló hatását úgy határozzuk meg, hogy azokat vizes, dimetil-szulfoxidos vagy etanolos oldatban az inkubálásra kerülő elegyhez adjuk, legfeljebb 5 térfoga tszázal ék, etanolos oldat esetében legfeljebb 2,5 térfogatszázalék végső koncentrárióban. A vizsgálandó vegyidet hatásának erősségét az 1C5 0 -értékkel fejezzük ki, ami a kontroli aktivitásához képest 50%-os gátlást eredményező koncentrádót jelenti. Ezeket az ICj c -értékeket grafikusan határozzuk meg. nevezetesen az ordinátára a százalékban kifejezett gátlás értékét, míg az abszdsszára a pmólban kifejezett koncentrádó logaritmusát visszük fel. A fenti modellkísérletben néhány vegyületre az alábbi ICjo -értékeket kaptuk, pmól/liter dimenzióban kifejezve: N [3-[3-(4-acetil-3-hidroxi-2-n-propil-fenoxi)-propil-ox ]-2-dano-fenil] -oxaminsav-trietanol-ammóniumsó. 30. N (3-[3-(4-acetil-3-hidroxi-2-n-propil-fenoxi)-propil-oxi j-feni(]-oxaminsav-trietanol-ammóniumsó : 23, N [3-[3-(4-acetil-3-hidroxi-2-n-propil-fenoxi)-propil-oxi]-4-bróm-6-metil-fenil] oxaminsav-trietanol-ammóniumsó . 15, N l3-[3-(4-acetil-hidroxi-2-n-propil-fenoxi)-propil-oxi] 4-bróm-6-metil-fenil1 -lH-tetrazol-5-karboxamid-trietanol-ammóniumsó : 10, N Í3-[3-(4-acetil-3-hidroxi-2-n-propiI-fenoxi)-propil-oxi]-2-dano-fenil}-lH-tetrazol-5-karboxamid-trietanol-ammóniumsó 20, N-[3-[3-(4-acetil-3-hjdroxi-2-n-propil-fenoxi)-2-hidroxi-propil-oxi]-2-dano-fenilj -oxaminsav-nátriumsó : 100-nál hatástalan, N-|3-[3-(4-acetil-3-hidroxi-2-n-propil-fenoxi)-2-hidr-4
