198393. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hatóanyagként pirimidin-nukleozid származékokat tartalmazó, hepatitisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
1 198 393 2 a várható sejt-metabolizmus folyamatok miatt szükséges. A jelzetlen nukleozid-trifoszfátokat a Sigma cég (Chemical Company, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok gyártotta. A triciummal jelzett dezoxiribonukleozid-trifoszfátokat, a l3H]-dTTP-t (30 Ci/mmól), [3H]-dATP-t (24 Ci/mmól), [3H]-dCTP-t (17 ci/mmól) és [3H]-dGTP-t(9,5: Ci/mmól) az Amersham cégtől (Amershal, Franciaország) szereztük be. Az ACV-t a Burroughs Wellcome-tól (Chapel Hill NC) kaptuk; a BVdU szintézise De Clerq és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 76, 2947-2951 (1979)], a FIAC szintézise Lopez és munkatársai [4 211 773 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] munkájából ismert. Mind a három nukleozid-analógot a megfelelő 5’-trifoszfát-származékká alakítottuk, Allaudeen és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78, 2698— 2702 (19810] eljárása szerint. A trifoszfátok tisztaságát 1 H-NMR-mérésekkel vizsgáltuk, Bruker FIX-270 spektrométer segítségével, és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárássel, Altex Model 332 grádiens folyadékkromatográf segítségével. A DNS-polimeráz vizsgálatát Kaplan és munkatársai [J. Virol. 12, 995 (1973)] eljárása szerint végeztük, kis módosítással. A vizsgálatot 50 mmól/1 Tris-HC 1-t (pH 7,6), 40 mmól/1 magnézium-kloridot, 60 mmól/1 ammónium-kloridot, 100 jümól/1 dATP-t, 10Ó qmól/1 dCTP-t, 100 qmól/1 dGTP-t, 0,2-0,7 /umól/1 [3H]-dTTP-t (30 Ci/mmól), 10 mmól/1 2-merkapto-etanolt, 0,5 % Nonidet P 40-et és enzimet tartalmazó 50 fű térfogatú reakcióelegyben végezzük. A reakciót a 2-merkapto-etanollal és Nonidet P 40-nel együtt a vírus-részecskék hozzáadásával indítjuk el. Az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. A savoldhatatlan radioaktív anyagot üvegszál szűrőn (GF/C Whatman)' gyűjtjük össze. A szűrőket ötször mossuk 10 mmól/1 nátrium-pirofoszfátot tartalmazó 5 %-os, hideg triklór-ecetsav-oldattal, majd 95 %-os etanollal. A száraz szűrő radioaktivitását folyadék-szcintillációs számlálóval mérjük. Az endogén DNS-polimeráz reakció termékeként keletkező [32P]-DNS-t Summers és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 4597—4601 (1975)] módszere szerint határozzuk meg, agaróz-gél-elektroforézissel. A reakciót 15 fű standard DnS-polimeráz elegyben, 1 jumól/1 [32P]-dCTP (500 Ci/mmól), mint jelzett nukleotid jelenlétében játszatjuk le. A reakcióelegyet 37 °C-on 2 órán át inkubáljuk, majd a reakciót 10 mmól/1 Trist-t, 10 mmól/1 EDTA-t, 0,1 mg/ml proteináz K-t és 0,1 vegyes % nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 20 fű elegy hozzáadásával leállítjuk, és 37 °C- on 60 percen át tovább inkubáljuk. 5 jul, 5 vegyes %-os szacharózoldatot és 1 % bróm-fenolkéket adunk hozzá, és a kapott elegyet 65 °C-on egy percen át melegítjük, majd ózonnal 0 °C-ra hűtjük és 1 % agarózt tartalmazó horizontális géllemezen elektroforetizáljuk. Az elektroforézis befejeztével a gélt szárítjuk és autoradiográfiásan előhívjuk. A HBV- és WHV-részecske preparátumokban lévő DNS-polimeráz specificitását és a polimerizációs reakció hatékonyságát az endogén reakcióban keletkezett jelzett DNS analízise alapján ellenőrizzük. A DNS-polimerázok vizsgálatát a fent leírt módon, jelzett nukleotidként /32P/dCTP-t használva végezzük. A reakcióterméket agarózgél-elektroforézis és autoradiográfia segítségével analizáljuk. Az eredmények szerint a reakció 13, 30, 120 és 180 perce alatt progresszív a HBV és WHV DNS szintézise. A HBV esetén egy teljes, 3300 bázis hosszúságú DNS, és a virális genom egyes szálú régiójának nem tökéletes kitöltése miatt kisebb (1,8-2,8 kb) DNS-darabok keletkeznek. A WHV DNS-polimeráz reakcióterméke sokkal heterogénebb, és kissé gyorsabban vándorol; 180 percnyi reakcióidő alatt 3100 bázisból álló hosszabb WHV DNS szintetizálódik. A HBV és WHV DNS-polimeráz FIACTP-vel, FMAUTP- vel, ACVTP-vel, ara-TTP-vel, ara-CTP-vel és BVdUTP-vel szembeni relatív érzékenységét nukleotid-felesleget alkalmazva hasonlítottuk össze. Minden egyes inhibitor esetén a megfelelő radioaktív trifoszfát koncentrációját a Km érték 2-3-szorosának megfelelő értéken tartjuk, míg a többi nukleotid nagy feleslegben (50 jumól/1) van jelen. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a HBV DNS-polimeráz leghatásosabb inhibitora az FMAuTP, és legkevésbé hatásos inhibitora az ara-CTp; a BVdUTP és ara-TTP hasonló gátlást mutat. A WHV DNS-polimerázzal is hasonló eredményeket kapunk. A HBV és WHV DNS-polimerázok 50 %-os gátlásához szükséges trifoszfát-koncentrációkat az 1. táblázatban tüntetjük fel. 1. táblázat: Nukleozid-trifoszfát analógok gátló hatása HBV és WHV DNS-polimeráz enzimre Vegyület IDsS" Gumói/1) HBV DNS- polimeráz WHV DNS- polimeráz FMAUTP 0,025 0,05 FIACTP 0,05 0,10 BVdUTP 0,25 0,30 ara-TTP 0,30 0,40 ACVTP 0,90 0,70 aia-CTP 1,10 1,20 IDS0 a DNS-polimeráz 50%-os gátlását okozó koncentráció Az 1. táblázat eredményei alapján megállapíthatjuk, hogy a HBV és WHV DNS-polimeráz legerősebb inhibitora az FMAU. A másik 2’-fluor-arabinozil-pirimidin-nukleotid, a FIAC is erősen, de az FMAU-hoz képest kisebb mértékben gátolja a virális DNS-polimerázokat. Az FMAU IDS0 értéke igen alacsony (0,025, illetve 0,05 jumól/1) a BVdUTP-vel és az ACVTP-vel kapott értékekhez képest, amelyek a HBV DNS-polimeráz esetén 10-szer, illetve 36- szor, a WHV DNS-polimeráz esetén 6-szor, illetve 24-szer nagyobbak. 4z a tény, hogy a gátlás erőssége szempontjából a vegyültek sorrendje azonos a kétféle — állati, illetve humán fertőzést okozó vírúsból származó - DNS-polimeráz esetén, azt jelzi, hogy a mormotát valóban használhatjuk állatkísérletes modellként a Hepatitis vírus replikációjának tanulmányozására. Noha ismeretes, hogya különféle vegyületek hatásmódja eltérő, megvizsgáltuk az ACVTP, FIACTP és BVdUTP hatását a HBV és WHV DNS-polimerázok katalizálta virális DNS-szintézisre, oly módon, hogy növekvő szubsztrátkoncentrációk mellett meghatároztuk a gátlás mértékét. Az ACVTP-vel végzett vizsgálatokban a sebességet meghatározó szubsztrát a /3H/-dGTP, míg a többi három nukleotid feleslegben van. FIACTP esetén /3H/-dCTP-t, míg BVdUTP esetén /3H/-dTTP-t használunk, hasonló feltéte5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
