198220. lajstromszámú szabadalom • Eljárás S-184 heteropoliszacharid előállítására
5 HU 198220 B6 100 °C-on 1 mól/l-es kén savval hidrolizáltunk. Lehűtés után 0,5 ml 3 mg/ml xilózt adtunk hozzá belső standardként. A mintákat 3 ml telitett bárium-hidroxiddal semlegesítettük, majd 2 csepp kongó-vörös hozzáadása után addig adagoltuk a bárium-hidroxidot, mig a Bzin vörösre nem váltott. Centrifugálás után (20 perc, 3000 ford/perc) a minták felülúszóját bepároltuk. A száraz mintákat 0,1 ml 40 mg/ml-es, száraz piridinnel készült hidroxil-amin-hidroklorid-oldatban oldottuk, és 45 percig 90 °C-on melegítettük. Lehűtés után 0,1 ml acetanhidridet adtunk hozzá, és újra 45 percig 90 °C-on melegítettük. A cukrokat 'aldonitril-acetát-származékaik gáz-folyadék-kromatogréfiájával választottuk el, és autentikus mintákkal történd összehasonlítással azonosítottuk, és határoztuk meg mennyiségüket (J.K. Baird, M.J. Holroyde és D.C. Ellwood, Carbohydr. Rés. 27, 464-467 /1973/). (4) A fenti módszerrel végzett semleges cukor meghatározás elótt a mintákat 72%-os kénsavban oldva 1 óra hosszat 0 °C-on előkezeltük. A kapott értékek átlagértékek a BD-707, BD-2117 és BD-2118 mintákra. (5) A semleges cukrokat egy másik módszerrel is meghatároztuk. 2 mg S-184 heteropoliszacharidot feloldottunk 2 ml 0,5 mól/l-es trifluor-ecetsavban. A mintákat éjszakán át 100 °C-on tartottuk, szárazra pároltuk, majd 2 ml vízben oldottuk. 25 mg nátrium-bór-hidridet adtunk hozzá, majd 2 óra múlva az oldatot Dowex 50 (H*)-val kezeltük, Így a pH 3,5-re csökkent. Szűrés után az oldatot koncentráltuk, és háromszor 5 ml metanollal kodesztilláltuk. A maradékot feloldottuk 1 ml acetanhidrid és 1 ml piridin elegyében, 1 óra hosszat 100 °C-on tartottuk, és betőményitettük. Háromszor 5 ml toluollal történt kodesztillálás után a maradékot metilén-kloridban oldottuk, és géz-folyadék-kromatográfiával analizáltuk. A kapott eredmények átlagértékek a BD-707, BD-2117 és BD-2118 mintákra. A poliszacharid uronsavtartalmát úgy határoztuk meg, hogy dekarboxilezést végeztünk 17X-08 sósavval, és a felszabaduló szén-dioxidot nátrium-hidroxid-standardban felfogtuk, és vÍ8szatitráltuk (B.L. Browning, Methods of Wood Chemistry 2, 632-633, /1967/). A piroszőlősav hiányát úgy határoztuk meg, hogy 1 ml, 2 mg/ml-es S-184 heteropoliszacharid-oldatot mértünk egy kémcsőbe, hozzáadtunk 1 ml 0,2 n sósavat és 4 óra hosszat 100 °C-on tartottuk. A hidrolizátum 0,5 ml-ét hozzáadtuk 0,1 ml redukált nikotin-amid-adenin-dinukleotid (NADH) és 2,4 ml trietanol-amin-oldat elegyéhez. Az abszorpció változását mértük spektrofotométerrel, és a piroszólósavat meghatároztuk (Duckworth és Yaphe, Chem. and Ind., 747. oldal /1970/). Piroszőlősav nem volt megfigyelhető. A nitrogénmeghatározást Kjeldahl-módszerrel végeztük, mintegy 1,9 és 2,5 tömegX közötti értékeket mértünk, amely 11,8-15,8X proteinnek felel meg. A metilezési analízist részlegesen tiszti- . tott S-184 mintákon végeztük dialízis és fagyasztva szárítás után. A minták metilezését a Sandford és Conrad, Biochem. 5, 1508-1507 (1966) helyen ismertetett módon végeztük. A cukrok O-metil-étereit aditol-acetátjuk formájában gázkromatográfiásán választottuk el, és autentikus mintával való összehasonlítással számítógéppel azonosítottuk. A nagyobb, azonosított metilezett cukrokat a II. táblázatban foglaltuk össze. II. táblázat S-184 heteropoliszacharid metilezett cukorrészei Azonosított cukorrész Kapcsolódás 2.3.6 Me3 hexitoí (gálák tóz) 1-4 2.3.6 Me3 hexitol (mannóz) 1-4 2.3.6 Me3 hexitol (glükóz) 1-4 A teljes szénhidráttartalmat a fenol-kénsavas módszerrel (Dubois és munkatársai, Anal. Chem. 28, 350 /1959/), standardként glükózt használva határoztuk meg, azaz az eredmények glükóz-egyenértékben vannak megadva. A különböző monoszacharidok különböző abszorbanciát mutatnak ebben a módszerben, mivel ismerjük az S-184 heteropoliszacharid monoszacharid-összetételét, ezeket az abszorbancia-értékeket a következőképpen korrigáljuk: Relatív abszorbancia Monoszacharid arány (hozzávetőleg) Glükóz 0,78 3 Mannóz 1,01 1 Gálák tóz 0,664 5 Glükuronát 0,287 1 10 A korrigált teljes szénhidráttartalmat úgy számítjuk, hogy a glükóz-egyenértékben kapott teljes szénhidráttartalmat szorozzuk a következő faktorral: 5 io 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
