198103. lajstromszámú szabadalom • Enzimes eljárás 3-helyettesített cephalosporinok előállítására
metanol/diklór-mctán-elcggycl végezzük, így 0,77 g terméket kapunk, (10% izoftálsavból). TLC (metanol/diklór-metán, 3:97 arányban): Rf = 0,5. Op.: 148-149 °C (kloroformból). IR (KBr tárcsa): 2600-3300 (b), 1728 (s), 1607 (m), 1522 (m), 1425 (m), 1378 (s), 1351 (m), 1284 (m), 1231 (m), 1198 (m) cm-1. JH-NMR (300 MHz, CDC13): 5 3,74 (2H, s, ArC//2C02), 5,47 (2H, s, C02C//2Ar), 7,46 (1H, t, J=9 Hz, Ar-H), 7,51 (1H, d, 1=9 Hz, Ar-H), 7,61 (2H, d, J=9 Hz, Ar-H), 8,01 (1H, s, Ar-H), 8,02 (1H, d, J=9 Hz, Ar-H), 8,26 (2H, d, J=9 Hz, Ar-H). m/e (deszorpciós kémiai ionizáció): 333 (M+NHÎ), 288,198(100%). Analízis: CJ6H13N06 képletre: számítottá 60,95; H 4,61 ; N4,44%; talált: C 60,90; H 4.11; N4,31%. 3) 6j3-[3-(4-nitro-benziloxi-karbonil)-fenil-ace tilamino3-2,2-dimetll-penam-3-karbonsav-4-nitrobenzilésztcr 142 mg (0,45 mmól) 6-amino-peniciilánsav-p-nitrobenzilészter, 235 mg (0,45 mmól) 3-(-p-nitro-benziloxi-karbonil)-fenil-ecetsav-p-toluol-szulfonátsó, 63 pl (0,45 mmól) trietil-amin és 111 mg (0,45 mmól) 1- etoxi-karbonil-2-etoxi-l ,2-dihidrokinolin (EEDQ) 3 ml diklór-metánnal készített oldatát semleges légkörben keverjük 15 óra hosszat 20 °C-on. Az elegye! ezután 50 ml etil-acetáttal hígítjuk, 25 ml vizes nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal, 25 ml telített konyhasőoldattal, 25 ml 10%-os citromsavoldattal és 25 ml telített konyhasóoldattal mossuk, Na2SŰ4 felett szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot kromatografáljuk szilícium-dioxidon, az eluálást etil-acetát/40-60 petroléter-eleggyel végezzük. Ily módon 186 mg terméket kapunk, amely 64%-os kitermelésnek felel meg. IR (CHCJ3): 3420 (m), 3030 (m), 2970 (w), 2930 (w), 1785 (s), 1750 (s), 1740 (s), 1690 (s), 1610 (s), 1525 (s) cm-1. ‘H-NMR (300 MHz, CDC13): 5 1,39, 1,49 (2X3H, 2Xs, 2XCH3), 3,70 (2H, s, ArC//2CO), 4,45 (1H, s, 2- H), 5,25, 5,50 (2H, ABq, J= 13 Hz, CHjArNOï), 5,47 (2H, ca. s, CH2ArNOJ, 5,52 (IH d, J=4 Hz, 5—H), 5,68 (1H, dd, J=9,4 Hz, 6-H), 6,07 (1H d, J=9 Hz, HH), 7,45-7,63 (6H, m, Ar-H), 7,99-8,06 (2H, m, Ar-H), 8,20-8,46 (411, m, Ar-H). m/e (deszorpciós kémiai ionizálás), 355 (10%), 295 (12%). [a]o° = +99,9Ö (c = 0,96, CHCI3). A diészterről eltávolítjuk az észtercsoportokat, és így a cím szerinti vegyületet kapjuk a következő módon: 20mg (3,IX 10-í mmól) fenti termék 4 ml 50%-os vizes tetrahidrofuránnal készített oldatát, amely 5,2 mg (6,2X10”2 mmól) nátrium-hidrogénkarbonátot tartalmaz, 20 mg 10%-os szénre felvitt palládium felett hidrogénezzük 30 percig. A reakcióelegyet ezután cclitcn szűrjük, 5 ml ctil-acctáttal mossuk és szárazra pároljuk, így 11 mg cím szerinti vegyületet kapunk 84%-os kitermeléssel dinátriumsó alakjában. 13 8 ’lI-NMR, m/e és HPLC tartózkodási idő ugyanaz, mint a természetes bioszintézissel kapott vegyület esetén. 7. elöállitásmód Dezacetoxi-cefalosporin C szintetáz tisztítása: gyűrű-expandáz aktivitás Acremonium Chrysogenumból (Cephalosporium acremonium). 1. Az organizmus tenyésztése Acremonium chrysogenum C0728 törzset tenyésztünk valamely kémiailag meghatározott közegben. A tenyésztést 550 nm-nélPye Unicam SP6—550 spektrofotométerrel követjük. A micellákat összegyűjtjük és -70 °C-on tároljuk. 2. Sejtmentes kivonatok készítése Ezeknek a készítéséhez egy Dyno-Mill őrlőgépet (Glcn Crcston, Stnnmorc, Middx.. G. H.) használunk folytonos módszer szerint. Ennek során 50 mmól Trisz/HCl puffert használunk, amelynek a pH-ja 7,4 és amely 1 mmól DTT-t és 0,015% nátrium-azidot tartalmaz. 3. Enzimtisztitás (a) Kezdeti szakaszok Minden lépést 4 °C-on végzünk. Protamin-szulfátot adunk a sejtmentes kivonathoz 0,5%-os végső koncentráció eléréséig. Az elegyet 12 000 g-nél 30 percig centrifugáljuk, és a felülószóhoz ainmónium-szulfátot adunk 55%-os végső koncentráció eléréséig. Kiegyensúlyozás és centrifugálás után (12 000 g 30 percig), a felülúszót 75 %-osra állítjuk be ammónium-szulfátban, és a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük 12 000 g-nél 30 percig. Ezt az anyagot újra feloldjuk az extraháló pufferben, és egy Scphadcx G- 75 jelű gélszűrő oszlopra (amelynek a mérete 130X5 cm) visszük és extraháló puffernd egyensúlyba hozzuk, utána pedig éjszakán át 4 °C-on eluáljuk. A frakciók expandáz-aktivitását biopróbával megvizsgáljuk. Az aktív frakciókat egybegyűjtjük és sebes folyású (folyási sebesség = 24 ml/óra) DEAE-Sepharose oszlopra visszük (10X5 cm), amelyet előre kiegyensúlyoztunk extraháló pufferrel 4 °C-on. Az enzimaktivitást 0,051 mólos lineáris gradiensű NaCl-el, 500 ml felett, 24 ml/óra folyási sebességnél eluáljuk. Az aktív frakciókat, amelyeket biopróbával határoztunk meg, összegyűjtjük és az anyagot kezdeti tanulmányozásra használjuk. (b) Szinezék-ligand, ioncserélőFPLC, ésgélszürö FPLC kromatográfia Közelítően homogén anyag előállítására, az összegyűjtött aktív frakciókat a Scphadex G—75 oszlopon való kromatografálás után 10 ml/órn folyási sebességgel egy 30X2,5 cm méretű, agarózhoz kapcsolódó Procion Red HE3B oszlopra visszük (Matrex Gél i4 198 1U3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
