198103. lajstromszámú szabadalom • Enzimes eljárás 3-helyettesített cephalosporinok előállítására
1 198 103 A találmány tárgya közelebbről megjelölve enzimes eljárás valamely 2a-hclycUesítctt páramnak 3-liclycttesített 3-cefem-4-karbonsawá történő alakitására expandáz enzim felhasználásával. Az expandáz enzim, amely dezacetoxi-cefalosporin C szintetáz néven is ismert, részt vesz a cefalosporin C-nek Cephalosporium acremonium, valamint más organizmusok közreműködésével történő bioszintézisében. Az expandáz átalakítja a penicillin N-t dezacetoxi-cefalosporin C-vé, ahogy azt az alábbi bioszintetikus lépések sora mutatja. 5-(L-a-amino-adipoil)-L- ciszteinil-D-valin i/.opcnicillin N szintetáz izopenicillin N I epimeráz penicillin N I expandáz dezacetoxi-cefalosporin C -| hidroxiláz dezacetil-cefalosporin C I acetil-transzferáz cefalosporin C Az expandázt Scheidegger, A., et al., J. Antibiotics, 37, 522-531 (1984) és Kupka, J., et al., FEMS Microbiology Letters, 16 (1983) pp. 1—6. irodalmi helyeken ismertetett módon tanulmányozták és írták le. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a penicillin N-a-amino-adipoil-csoportját m-karboxifenil-acetil-csoporttal vagy adipoilcsoportt3l helyettesítjük, és így olyan penam-vegyületet kapunk, amelyet expandáz segítségével eredményesen cefalosporinná alakíthatunk. Így például a 6/J-(3-karboxi-fenil-acetiiamino)-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavat eredményesen alakíthatjuk át 70-(3-karboxi-fenil-acetÍl-amino)- 3-metil-3-cefem-4-karbonsawá. Ezenkívül a penicillin N-a-amino-adipoil-csoportját hasonlóképpen helyettesítheti az adipoilcsoport, így olyan penam-vegyület keletkezik, amelyet szintén eredményesen alakit át az expandáz. Felismertük, hogy a fcnil-acetil-csoport nem felel meg annak a feladatnak, hogy helyettesítse a penicillin N-a-amino-adipoil-csoportját. Más acilcsoportok, amelyek esetében - ha azok a 6-os helyzetű aminocsoporthoz kapcsolódnak — az expandáz nem képes a penam vegyülct átalakítására, ilyenek a fenoxiacetil-, 5-(L-a-amino-adipoil)- és az 5-atnino-valerilcsoportok. A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletű 3 -hely ettesített -3- cefcm -4- karbonsav - származékok előállítására, e képletben R 3-karboxi-fenil-acetil- vagy adipoilcsoport, és Rí valamely 1—3 szénatomos alkilcsoport. Az eljárásra az jellemző, hogy vizes közegben 20 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, és 6 és 9 közötti pH-n valamely (II) általános képle tű 20-metil- 2 2a-hclycttcsítctt penum-3-karbonsavat. c képletben R és Rí jelentése a fenti, dezacetoxi-cefalosporin C szintetázzal hozunk érintkezésbe ferroion, aszkorbát, és a-ketoglutarát jelenlétében. Az eljárást oxigén jelenlétében vitelezzük ki. Kis laboratóriumi méretben elegendő oxigént adagolunk nyitott reakcióedény használatával. Nagy méretben, különösen ha nagy feleslegben használunk enzimet, akkor oxigént úgy adagolunk, hogy levegőt vagy oxigént vezetünk be az inkubációs elegybe. Az inkubációs elegyet alapos mozgásban tartjuk keveréssel, vagy rázással a folyamat alatt. Az eljárás során alkalmazásra kerülő expandáz enzim előnyösen tisztított, de félig tisztított enzimet is használhatunk, mégpedig olyan enzimet, amelyet az enzim részlegesen tisztított sejtmentes extraktumaiból kapunk. Az expandázt számos mikroorganizmusból kapjuk, ilyenek például a Cephalosporium acremonium, a Streptomyces clavuligerus, és a Streptomyces lipmanii. A Cephalosporium acremonium törzs vagy törzsek (így az ATCC 48272, és az ATCC 36225 törzsek), amelyek nagy titerű cefalosporin C-t termelnek, az enzim megfelelő forrásai. Az enzim sejtmentes extraktumait ismert módszerekkel, például A. Scheidegger et al. által a fent említett irodalmi helyen ismertetett módon kaphatjuk. Az enzimet előnyösen lényegében tiszta fonnában használjuk, például olyan enzimet alkalmazunk, amelyet részben tisztított sejtmentes kivonatokból kromátográfiás szétválasztással kaptunk. Az expandázt előnyösen nagy feleslegben alkalmazzuk althoz a mennyiséghez mérten, amennyi szükséges a penicillinnek cefalosporinná történő átalakításához. Ismeretes penicillin N-nek expandáz segítségévei történő átalakításánál adalékanyagok, így ferroion és aszkorbát, valamint a-ketoglutarát használata az enzimaktivitás növelése érdekében. Ennek megfelelően ezeket az anyagokat alkalmazzuk a találmány szerinti eljárásnál is. Az enzim aktiválása érdekében nagyon kis mennyiségű ferroionra van szükség. A ferroion koncentrációja általában körülbelül 25 mM, és 0,2 mM között mozog. Általában minél nagyobb tisztaságú az enzim, annál kisebb mennyiségű ferroion szükséges a legnagyobb enzim-hatás eléréséhez. A ferroion forrásai a sók, így a ferroklorid, ferro-szulfát vagy a ferro-karbonát. A ferroszulfát előnyösen használható a találmány szerinti eljárásnál. Az adalékként használt aszkorbát előnyösen L-aszkorbinsav, a nátrium- vagy a kálium-L-aszkorbát, és mennyisége általában megegyezik a ferroion mennyiségével, de ennél nagyobb is lehet. Az a-ketoglutarát előnyösen mononátrium- vagy monokáliumsó formájában kerül felhasználásra, és mennyisége előnyösen körülbelül 0,5 mM és körülbelül 2 mM között van, a célszerűen alkalmazott mennyiség körülbelül 1 mM. A (II) általános képletű penicillint a találmány szerinti eljárás során körülbelül 0,1 mM, cs körülbelül 5 mM közötti mennyiségben használjuk. Az eljárást 6 és 9 közötti pH, előnyösen 7,5-8 pH-tartományban vitelezzük ki. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
