198102. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és hatóanyagként ezen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
15 198 102 16 (3) Antimikrobiális aktivitás A találmány szerinti eljárással előállított barminomicin I és ír, valamint a karminomicin III antimíkrobiális aktivitását agar-hígításos módszerrel [J. Antibiotics 38, 1171 — 1181 (1985)] határozzuk meg. A minimális inhibitor koncentráció (MIC) értékeket a 7. táblázatban ismertetjük. 7. táblázat Antimikrobiális hatás MIC (jug/ml) Mikroorganizmus Bárminő micin I- Barminomicin Ir Karminomicin III Staphylococcus aureus FAD 209P 0,2 0,78 3,12 S. aureus Smith 0,2 0,78 3,12 S. aureus MS8710 0,2 1,56 1,56 S. aureus MS9610 0,2 1,56 1,56 Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 0,2 0,78 1,56 Bacillus subtilis PCI 219 <0,1 0,39 1,56 Escherichia coli N1IÍJ 3,12 50 >50 E. coli K-12 0,78 6,25 >50 E. coli BEI 121 <0,1 0,2 1,56 E. coli BEI 186 <0,1 0,2 1,56 Klebsiella pneumoniae PCI 602 0,39 6,25 50 Serratia marcescens 0,78 3,12 25 Proteus vulgaris OX19 3,12 >50 >50 Pseudomonas aeruginosa A3 1,56 12,5 >50 Mycobacterium smegmatis 607 0,78 6,25 6,25 1. példa (lj Inokulum előállítása A tenyésztést az alábbi összetételű tápközegben végezzük: glükóz 1 % glicerin 1 % szaccharóz 1 % zabliszt o,: 5% adipron (kereskedelmi név) 2 % press-yeast (kereskedelmi név) 1 % kazein-aminosavak o,: 5% kalcium-karbonát o,: 1% (pH 7,0-re állítva sterilezés előtt) A fenti tápközeg 100 ml-ét 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba öntjük és sterilizáljuk. A tápközeget 1 kacsnyi ferde agaron tenyésztett MG463-YF4-gyel leoltjuk. A lombikot rotációs rázógépen 30 °C-on 5 napon át rázatva tenyésztjük. (2) Fermentálás A fermentálást az alábbi összetételű tápközegben végezzük: glicerin 3^ .% halliszt 2 ' % kalcium-karbonát 0,2 % 15 liter fenti tápközeget 30 1-es fermentorba töltünk, majd leoltjuk 500 ml fenti módon előállított inokulummal. A tenyésztést 27 °C-on 48 órán át végezzük, 150 fordulat/perc keverési sebesség és 15 1/perc levegőztetés mellett. (3) Barminomicin I és II kinyerése A fenti módon kapott folyékony tenyészetet szűrjük, a szűrlet pH-ját 5-re állítjuk, majd a szűrletet Dia-Ion HP—20-szal töltött oszlopon (4,0X40 cm) adszorbeáljuk. Az oszlopot 6 liter vízzel, majd 6 liter 50%-os metanollal mossuk, és 5 liter 100%-os metanollal cluáljuk. Az cluátumokat koncentrálva 3,0 g vörös színű nyersterméket kapunk, por formájában, amely barminomicin I-et és Il-t tartalmaz. A port kevés kloroformban oldjuk, és az oldatot 50 g szilikagéllel (KieselgélR 60, Merck) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot kloroform és metanol elegyével cluáljuk, sűrűség-gradienst alkalmazva. A barminomicin I-ct és Il-t tartalmazó frakciókat koncentrálva 40 mg barminomicin I-et és Il-t tartalmazó nyersterméket kapunk, vörös por formájában. 2. példa 40 mg 1. példa szerinti előállított nyers vörös port kevés kloroformban oldunk, és az oldatot felvisszük 10 db 20X20 cm-es, szilikagéi vékonyréteget tartalmazó lemezre (KieselgélR 60 F 254, Merck) és a kromatogramot klorofonn, metanol, ecetsav és víz 70:10:1:1 terfogatarányü clcgyévcl kifejlesztjük. A barminomicin I és II szétvált foltjait összegyűjtjük, és kloroform és metanol 2 :1 arányú elegyével eluáljuk a szilikagélről. Az így kapott frakciókat Nucleosil 5Ci8-on nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással tovább tisztítjuk, az. cluálást acetonitril, és 0,2%-os vizes foszforsav 40 :60 tér fogatarányú elegyével végezzük. 3,06 mg tiszta barminomicin I-et, és 3,07 mg tiszta barminomicin II t kapunk, vörös porok formájában. A termékek fizikai állandóit a 2. és 3. táblázat tartalmazza. 3. példa 4,5 mg 2. példa szerinti előállított barminomicin I-et 5 ml metanolban oldunk, és 2 mg NaBH3CN-del reagáltatjuk 15 percen át. A reakcióelegyet 20 ml vízzel és 20 ml kloroformmal extraháljuk, a kloroformos fázist vákuumban koncentráljuk. A koneentrátumot szilikagél-vékonyrétegen adszorbeáljuk, a futtatást klorofonn és metanol 10:1 térfogatarányú elegyével végezzük. A barminomicin Ír frakciókat összegyűjtjük, és kloroform és metanol 1 :1 térfogatarányú elegyével eluáljuk a szilikagélről. A kapott frakciókat 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
