198100. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-ergokriptin előállítására
1 198 100 2 A találmány tárgya eljárás a-ergokpritin előállítására, melyre jellemző, hogy a DSM 2836 számon deponált Claviceps paspali mikroorganizmust tenyésztjük, és a fermentáció befejezése után a képződött a-ergokpriptint izoláljuk. Közismert tény, hogy az a-ergokriptin, vagyis a 9,10“-dihidro-12 -hidroxi-2,-(l-metü-etil)-5'“-(2-metü-propU)-ergotámain-3',6',l8-trion, farmakológiailag hatásos vegyület. Az eddig ismert eljárásokkal azonban a nevezett vegyülctct fermentációs úton csak másféle ergotalkaloidokkal és peptidalkaloidokkal keverve sikerült előállítani (lásd a 31 04 151 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratot). Ezért a vegyület előállítása és annak izolálása igen költséges. Azt találtuk, hogy egy Claviceps spec, gombatörzs megfelelő tenyészközegben magas kitermeléssel képes a-ergokriptint termelni, amely nyomokban jelen levő argoclavintól eltekintve másféle ergotalkaloidoktól mentes. Ezt a Claviceps spec, törzset a Spartina alterniflora nevű, vadon élő pázsitfű-faj anyarozsából izoláltuk. A törzset — belső használatra — a SCHERING MECE 5227 megjelöléssel láttuk cl, és azt a Német Szövetségi Köztársaságbcli Mikroorganizmus Gyűjteményénél (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen) DSM 2836 szám alatt deponáltuk. A törzs szénforrásként szacharózt és nitrogénforrásként aszparagint tartalmazó agartáptalajon lapos, sárgás színű telepeket képez, amely kompakt miccliumbó! áll. A telepek átmérője 7 napig tartó tenyésztés után: 2—3 cm, míg 20 nap tenyésztési idő után: 6-8 cm. A szénforrásként szacharózt és nitrogénforrásként ammónium-szukcinátot vagy ammónium-citrátot tartalmazó agar-táptalajon a nevezett gomba lassan növekedő, domborúan ívelt, és az agar felületéről kissé kiemelkedő telepeket képez, melyek sárgásbarna színűek. Légmicéiiumok képződése folytán a telepek felülete érdes. A telepek széles felrojtozott. A telepek átmérője 14 nap elteltével 2—3 cm, míg 30 nap után 6-7 cm. A hifaszerű micéiium mellett még a kerektől a szabálytalanig terjedő formájú, rövid, gyakran láncokat alkotó és erősen fénytörő vakiuolákat tartalmazó sejtek is megfigyelhetők (szklerotikus sejttípus). A hifák átmérője: 3-4 pin. A vakuolákat tartalmazó sejtek átmérője: 6-10 pm, és ezek hossza: 10-25 pm. A találmány szerinti eljárást olyan körülmények között valósítjuk meg, melyeket rendszerint anyagcserén alapuló szintézisre szolgáló gombakultúrák tenyésztésénél szoktak alkalmazni. így az általában szokásos előkísérletekkel előbb meghatározzuk a leg- * alkalmasabb fermentációs körűimé nyékét, mint pl. kiválasztjuk a legmegfelelőbb táptalajt, a technikai körülményeket, mint pl. a hőmérsékletet, a levegőztetés mértékét, a pH-értékeket, valamint a mikroorganizmus germinációjának és fejlődésének optimális idejét. A fermentációs közegben szénforrásként például glükózt vagy' szacharózt használhatunk. A nitrogénforrás — többek között - aszparagin, ammóniumszukcinát, vagy ammónium-szulfát lehet. A táptalaj tartalmaz még a növekedés serkentésére szükséges anyagokat, példának okáért élesztőklvonatot, továbbá ásványi anyagokat, így kálium-, magnézium-, kalcium-, vas- és cinkkationokat, valamint szulfát-, foszfát-, nitrát és kloridanionokat, a szokásosan alkalmazott koncentrációkban. A fermentációt egy, vagy két lépesben lehet lefolytatni, mimcllett az előfermentáláshoz alkalmazott közeg a főfennentálás közegével azonos lehet, vagy attól különbözhet. Az előtenyésztésnél szénforrásként előnyösen glükózt, míg a főfermentációnál előnyösen szacharózt használunk. Az előtenyésztésnél használt táptalaj előnyösen 10-100 g/1 szénforrást, a főfermentációs közeg pedig előnyösen 100—300 g/1 szénforrást tartalmaz. A fermentáció kezdetén a közeg pH-ját előnyösen 4 és 6 közötti értékre állítjuk be. A tenyésztést kb. 10—35 °C közötti hőmérsékleti határok között végezzük, a 20-30 °C hőmérsékleti tartomány előnyös. A tenyésztést szigorúan aerob körülmények között valósítjuk meg, és az optimális fermentációs időt a szokásos módon, a képződött a-ergokriptin analitikai meghatározásával állapítjuk meg. A fermentáció befejezése után a keletkezett a-ergokriptint önmagában véve ismert módon izoláljuk. Például úgy járunk el. hogy a fermentálással kapott sarzsot valamilyen vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, így etil-acetáttal, metil-izobutil-ketonnal, diklór-metánnal, kloroformmal vagy tetraklór-etánnal extraháljuk, a kivonatokat bepároljuk, és a kapott nyers terméket kromatografálással, és/vagy kristályosítással tisztítjuk. Az alábbi kiviteli példa a találmány szerinti eljárás tüzetesebb megmagyarázására szolgál. Példa Claviceps spec. DSM 2836 mikroorganizmust az alábbi komponenseket tartalmazó táptalajon tenyésztjük: Szacharóz (100 g/1), citromsav (10 g/1), élesztőkivonat (0,1 g/1), káíium-dihidrogén-foszfát (500 mg/1), magnézium-szulfát-heptahidrát (300 mg/1), ammónium-szulfát (6 g/1), kalcium-nitrát-tetrahidrát (1 g/1), vas-szulfát-heptahidrát (7 mg/1), cink-szulfát-heptahidrát (6 mg/1), agar (16 g/1). A táptalaj pH-ját 5,1-re beáliít/uk, és ezt a szaporító tenyészetet 5—20 napig 30 °C hőmérsékleten inkubátorban tartjuk. Kb. 1 cm2-nyi micéliumdarabot steril körülmények között egy Ultrnturrax-bcrcndc/.és segítségével fclaprítunk 5 ml élettani konyhusóoldatban, és ezzel beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml előfermentációs közeget, amely 5,1 pH-ra van beállítva, és glükózt (100 g/1), citrom savat (7,5 g/1), kálium-diliidrogcn-foszfátot (0,59 g/1), magnézium szulfát-heptahidrátot (300 mg/1), ammónium-szulfátot (6 g/1), vas(ll)-szulfát-heptahidrátot (7 mg/1). cinkszulfát-beptahidrátot (7 mg/1), kalcium-nitrát-tetrahidrátot (1 g/1), valamint élesztőkivonatot (0,1 g/1) tartalmaz. Ezután a tenyésztést. 4 napon át 24 °C hőmérsékleten végezzük egy forgó-rázó berendezésben, melynek fordulatszáma: 220 fordulat/pcrc. Az így kapott clőtenyés/.ct 5 ml-nyi mennyiségét hozzáadjuk egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 80 ml táptalajhoz, amely 5,1 pH-ra van beállítva, 5 10 15 20 25 30 35 é0 *5 50 55 80 85 2
