198099. lajstromszámú szabadalom • Eljáráss festuclavin előállítására
1 198 099 2 A találmány tárgya eljárás festuclavin előállítására, melyet az jellemez, hogy a Claviceps paspali nevű, DSM 2838 szám alatt deponált mikroorganizmust tenyésztjük, és a fermentáció befejezése után a keletkezett festuclavint izoláljuk. Ismert tény, hogy a festuclavin (6,8-dimetíl-ergolin) kiindulási vegyületként hasznosítható farmakológiailag hatásos ergotalkaloidák bioszintézisénél, így többek között a farmakológiailag hatásos Nralkil-4,8- dimetil-ergolinok előállításánál (lásd a 189 485 számú csehszlovák szabadalmi leírást, referátum: C.A. 96, 1982, 143148 x). Az eddig ismert eljárások szerint azonban fermentációs úton csak a fenti vegyületnek más ergotalkaloidokkal való keverékét kapják meg, ezért a vegyület előállítása és izolálása meglehetősen költséges. Azt találtuk, hogy egy Claviceps paspali gombatörzs megfelelő tenyészközegben magas kitermeléssel és másféle ergotalkaloidoktól gyakorlatilag mentesen festuclavint produkál. Ezt a Claviceps paspali törzset a Paspalum nemzetségbe tartozó és Argentínában vadon termő pázsitfű-féleségen élő anyarozsból izoláltuk. A törzset — belső használatra — a SCHERING MBCE 12426 megjelöléssel láttuk cl, és azt a Német Szövetségi Köztársaság Mikroorganizmus Gyűjteményénél (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen) DSM 2238 számon deponáltuk. A törzs szénforrásként glükózt vagy szacharózt és nitrogénforrásként aszparagint, ammónium-szukcinátot vagy komplex nitrogénforrást, így peptont tartalmazó agar-táptalajon gyorsan növekvő telepeket képez, melyek hifákból, konidiunrokból, valamint rövid, megvastagodott és erősen vakuolizáit sejtekből állnak. A hifák átmérője: 4-5 pm. A konidiumok oválisak és a szélességük: 6—10 jum, hosszúságuk: 10—20 jum. A telepek szürkésfehér színűek, tömörek és fonatszerűen göndörödő felületűek, a szélük szabálytalanul kirojtosodott. A telepek átmérője 10 napi tenyészidő után: 1—2 cm, 35 napi tenyészidő után 4—5 cm. A találmány szerinti eljárást olyan körülmények között valósítjuk meg, melyeket rendszerint anyagcserén alapuló szintézisre szolgáló gombakultúrák tenyésztésénél szoktak alkalmazni. így az általában szokásos előkísérletekkel előbb meghatározzuk a legalkalmasabb fermentációs körülményeket, mint pl. kiválasztjuk a legmegfelelőbb táptalajt, a technikai körülményeket, mint pl. a hőmérsékletet, a levegőztetés mértékét, a pH-értéket, valamint a mikroorganizmus fejlődésének és' germinációjának optimális idejét. A fermentációs közegben szénforrásként például glükózt vagy szacharózt használhatunk. A nitrogénforrás — többek között — aszparagin, ammóniumszukcinát vagy valamilyen komplex nitrogénforrás, így pepton lehet. A táptalaj tartalmaz még növekedés serkentésére szükséges anyagokat, példának okáért élesztőkivonatot, továbbá ásványi anyagokat, így kálium-, magnézium-, kalcium-, vas- és cinkkationokat, valamint szulfát-, foszfát-, nitrát- és kloridanionokat, a szokásosan alkalmazott koncentrációkban. A fermentációt egy, vagy két lépésben lehet lefolytatni, mimellett az előfermentáláshoz alkalmazott közeg a főfermentálás közegével azonos lehet, vagy attól különbözhet. A fermentáció kezdetén a közeg plI-ját előnyösen 4 és 6 közötti értékre állítjuk be. A tenyésztést kb. 10-35 °C közötti hőmérsékleti határok között végezzük, a 20-30 °C hőmérséklet-tartomány előnyös. A tenyésztést szigorúan aerob körülmények között valósítjuk meg, és az optimális fermentációs időt a szokásos módon, a képződött festuclavin analitikai meghatározásával állapítjuk meg. A fermentáció befejezése után a keletkezett festuclavint önmagában véve ismert módon izoláljuk. Például úgy járunk el, hogy a fermentálással kapott sarzsot valamilyen vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, így etil-acctáttal, metil-izobutil-ketonna!. diklór-mctánnai, kloroformmal vagy tctraklór-ctánnal extraháljuk, a kivonatokat bcpároljuk, és a kapott nyers terméket kromatografálással és/vagy kristályosítással tisztítjuk. Az alábbiakban következő kiviteli példák a találmány szerinti eljárás tüzetesebb megmagyarázására szolgálnak. 1. példa Claviceps paspali DSM 2838 gombát az alábbi összetételű táptalajon tenyésztünk. Szacharóz (100 g/1). aszparagin (10 g/1), élesztőkivonat (0,1 g/1), kálium-dihidrogcn-foszfát (250 mg/1), magnézium-szulfát-heptahidrát (250 mg/1), káliumklorid (120 mg/1), kalcium-nitrát-tetrahidrát (1 g/1), vas-szulfát-hetaphidrát (20 mg/1), cink-szulfát-heptahidrát (15 mg/1), agar (18 g/1). A táptalaj píl-ját 5,1 értékűre állítjuk be. Ezt a nevelőtenyészetet 5—20 napon át 30 °C hőmérsékletű inkubátorban tartjuk. Kb. 1 cm2-nyi micéliumdarabot steril körülmények között egy Ultraturrax-bcrendezés segítségével felaprítjuk 5 ml élettani konyhasóoldatban, és ezzel beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 50 ml előfernrentációs közeget, amely szacharózt (100 g/1), peptont (20 g/1), kálium-dihidrogén-foszfátot (1 g/1), és magnézium-szulfát-heptahidrátot (250 mg/1) tartalmaz. A beoltás után a tenyésztést forgó-rázó berendezésben, 4 napon át, 24 °C hőmérsékleten és percenként 220 fordulattal folytatjuk le. Az így kapott előtenyészet 5 ml-nyi mennyiségét hozzáadjuk egy 500 ml-es Erlcnmeycr-lombikbau levő 50 ml táptalajhoz, amely 5,1 pH-ra van beállítva, és az alábbi komponensekből áll: szacharóz (100 g/1), aszparagin (10 g/1), élesztőkivonat (0,1 g/1), káliumdihidrogén-foszfát (250 mg/1), magnézium-szulfátheptalüdrát (250 mg/1), kálium-klorid (120 mg/1), kalcium-nitrát-tetrahidrát (1 g/1), vas-szulfát-heptahidr.it (20 mg/1), és cink-szulfát-hcptahidrát (15 mg/i). Ezután a beoltott táptalajt 7 napon át egy forgó-rázó berendezésben, 240 fordulat/perc sebességgel rázatjuk, 24 °C hőmérsékleten. Ezt követően a tenyészközeget megszűrjük, és a fesíuciavin-tartalmát van Urk-fcle reakcióval (Microehim. Acla, 1959, 619 — 630) fotometriásan meghatározzuk. A tenyésztésből kapott szűrlet koncentrációja: 2,28 g/1. 5 13 15 23 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
