198089. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a gonadotropint felszabadító hormon antagonista dekapeptid származékok előállítására
9 198 089 10 A 13. lépés után a gyanta egy kis részletét kiveszszűk, és ninliidrin-próbát végzünk. Ha a próba negatív, akkor visszamegyünk a műveleti rend 1. lépéséhez, és kapcsoljuk a következő aminosavat; ha a próba pozitív vagy kismértékben pozitív, akkor visszamegyünk a műveleti rend 9. lépéséhez, és megismételjük a 9-13. lépést. Miután az első aminosavat a gyantához kötöttük, a jelen találmány szerinti pepiidben szereplő valamennyi aminosavat a fenti műveleti rend szerint kapcsoljuk a már meglevő részlethez. A szintézis során valamennyi aminosav cr-aminocsoportját tercierbutoxi-karbonilcsoporttal védjük. Az a-aminocsoportján tercier-butoxi-karbonilcsoporttal védett D-/3-(2- naftilj-alanint önmagában ismert módszerrel, például a 4 234 571. számú, 1980. november 18-án közzétett amerikai szabadalmi leírásban részletesen ismertetett módon állítjuk elő. Az arginin oldalláncát p-toluol-szulfonilcsoporttal védjük. A szerin hidroxilcsoportjának védésére benzilcsoportot használunk. Az indolgyűrű 6-os helyzetében nitrocsoporttal helyettesített D-triptofant nem védjük. Utolsóként az a-aminocsoportján tcrcier-butoxi-karbonilcsoporttal védett D-j3-(2-naftil)-alanint kapcsoljuk. Az a-aminocsoportján tercier-butoxi-karbonilcsoporttal, és az oldalláncban levő guanidinocsoporton p-toluol-szulfonilcsoporttal védett arginin, valamint az a-aminocsoportján tercier-butoxi-karbonilcsoporttal védett, és az indolgyűrű 6-os helyzetében nitrocsoporttal helyettesített D-triptofán diklór-metánban rosszul oldódik, ezeket az aminosavakat dimetil-formamid és diklór-metán elegyeinek alkalmazásával kapcsoljuk. Miután az N-terminálisról lehasítjuk az a-aminocsoport védőcsoportját, ezen aminocsoportot úgy acetilczzük, hogy a szabad amino-vegyületet ecctsavanhidrid nagy feleslegével kezeljük, diklór-metánban mint oldószerben. A pepiidnek a gyantáról való lehasítását és az. oldalláncokban szereplő védőcsoportok 5 teljes lehasítását igen könnyen és lényegében kvantitatív kitermeléssel végezzük 0 °C hőmérsékleten, fluor-liidrogénsawat. A fluor-hidrogénsavval való kezelés előtt a gyantához kötött, védett pepiidhez savmegkötőszerként anizolt adunk. A peptid lehasí(ása és a védőcsoportok eltávolítása után a fluorlüdrogénsavat csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a gyantát 50%-os ecetsawal kivonatoljuk, és a kivonatot fagyasztva szárítjuk, ily módon porszerű anyag ^ formájában kapjuk a nyers pepiidet. A kapott pepiidet úgy tisztítjuk, hogy karboximetil-cellulózon (Whatman CM 32), gradiens elúcióval (0,05 mólostól 0,03 mólosig növekvő koncentrációjú ammónium-acetát-oldattal, metanol és víz 1 :1 2o arányú elegyében), ioncserélő kromatográfiai végzünk, majd pedig egy gélszűrővel töltött oszlopon n-butanol és 0,1 normál ecetsav-oldat 1 :1 térfogatarányú clcgyévcl cluálva mcgoszlásos kroinatográfiat végzünk. 25 Az így előállított peptid a különböző futtató elegyekkel végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat, valamint a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat (elnens: vizes trietil-ammónium-foszfát-oldat és acetonitril elegye) szerint egy- 30 séges. A fentiek szerint előállított, tisztított peptid aminosav-analízise összhangban van a várt szerkezettel, és a peptidláncban szereplő valamennyi aniinosavra lényegében egészszámú értékeket ad. A termék optikai forgatóképessége egy fotoelektromos polari- 35 méteren mérve: [a]22 — -31,8° ± 1 (c = 1,50%-os ecetsavban). I. Tábhizat A fenti eljárás szerint eljárva állítjuk elő a 4—4C sz., Ac-R1-k2-R3-Ser-R5-R6-R7-Arg-Pro-Rlo általános képlet í peptideket: Peptid száma 1 r2 r3 Rs r6 Rr Rio K (c = l, 50%-os ecetsavban) 2. 0-D-2-NAL (4CI)-D-Phc D-Trp fyr D-Arg Tyr D-Alu-NII2 — 18,8° 3. 0-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-Trp Tyr D-Arg Phe D-Ala-NIL-22,5° 4. 0-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-Trp Tyr D-Arg (4F)-D-Phe D-Ala-NH2-23,8° 5. ß-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg D-Trp Leu D-Ala-NH2-30,3° 6. dehidro-Pro (4N02)-D-Phe (6N02)-D-Trp Arg I3-D-2-NAL Leu Gly-NH2-74,3° 7. 0-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg D-3PAL NMcLcu D-Ala-NH2-33,r 8. ß-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg (3-D-2-NAL 3 PAL D-Ala-NIl2-19,6° 9. (3-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg (imBzl)D-His Leu D-Ala-NH2-23,0° 10. (3-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg (6N02)-D-Trp Leu D-Ala-NH2-35,0° 11. 0-D-2-NAL (4N02)-D-Phe D-3PAL Arg 0-D-2-NAL Leu D-Ala-NH2-29,0° 12. /3-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg ' D-Tyr Leu D-Ala-NH2-29,8° 13. (3-D-2-NAL (4C1)-D-Phe D-3PAL Arg (For)-D-Trp Leu D-Ala-NH2-24,3° 14. béta-D-2-NAL (4F)-D-Phe (6N02)-D-Trp Tyr D-Aig Leu D-Ala-Nl l2-24,5° 15. dehidro-Pro (4F)-D-Phc (6NÜ2)-D-Trp Tyr béta-D-2NAL Leu Gly-Nll2 84,9° 16. béta-D-2NAL (4F)-D-Phe (6NH2)-D-Trp Tyr D-Arg Leu Gly-NH2-31,2° 6
