198085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, véralvadásgátló hatású hirudinszármazékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 198 085 2 A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű véralvadásgátló hatású hirudin-származékok és c vegyületek fiziológiailag elfogadható sóinak előállítására. A képletben R jelentése hidrogénatom vagy S03H-csoport, X jelentése Ile, vagy Leu, Y jelentése Thr, m = 0 vagy 1, ahol az 5, 13, 15, 21, 27 és 38 helyzetben levő hat Cys csoport közül 2 mindig diszulfid-híddai van összekötve. A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy ílirudo mcdicináiis férgekből extrakcióval, kicsapássnl, membránszűréssel és/vagy kromatográfiás eljárással, és ezen eljárások kombinálásával polipeptideket különítünk el, majd a kapott polipeptidet kívánt esetben fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk. Az antikoagulánsok trombo-embóliás folyamatok profilaxiás kezelésére és gyógyítására szolgálnak; fő alkalmazási területük mindenekelőtt a vénás trombocmbóliákuál van. Antikoagulánsokat alkalmaznak ezenkívül a vérkonzervek előállításánál is. Erre a célra 4-hidroxi-kumarin- vagy 1,4-indandion-származékokat alkalmaznak; ezek a vegyületek azonban számos hátrányos tulajdonsággal rendelkeznek [1. Mutschler. Arzncimittclwirkungcn, 4. kiadás, Stuttgart, 375. oldaltól (1981)]. Célszerű olyan véralvadásgátlókat alkalmazni, különösen a humán-gyógyászatban, amelyek csekély toxicitást mutatnak és a metabolizmus során nem képződik belőlük a beteg szervezetre káros anyag. Véralvadásgátló hatást mutat a szervezet által előállított antitrombin II, de ezenkívül más fehérjék is, így például a szójababból nyerhető Kunitz-inhibitor is. Ez a gátló anyag inhibitálja az aktivált Xa faktort, és ily módon gátolja a véralvadás folyamatát; azonban az inhibitor specifitása oly csekély, hogy számos mellékhatás is fellép: így az inhibitor gátolja a plazmin és a tripszin hatását, ennek következtében a terápiás alkalmazás nem is jöhet szóba. Egyéb hatóanyagok, mint az Ascari- vagy Kazal-inhibitor csekély specifitásuk miatt nem hasznosíthatók. A hirudin [Merck Index, 9. kiadás, Rahway, 618. oldal, (1976) Pharmazie 36, 10. füzet (1981)] poiipeptid, amit Hirudo medicinalisból nyernek; ez a polipeptid specifikus antitrombin hatást mutat (1. Markwardt: vérszívó állatokból nyert véralvadásgátló hatóanyagok; Jena, 1963). E polipeptid elkülönítése és tisztítása azonban nehézkes, ami akadályozza alkalmazásának elterjedését. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy vérpiócából igen kedvező hatású (11) általános képletű polipeptid nyerhető. E képletben R jelentése hidrogénatom vagy -S03H csoport. A találmány tárgyát az (I) általános képletű hirudin-származékok előállítása képezi. A képletben R, X és Y jelentése a fentiekben megadottal azonos. R jelentése előnyösen —S03H csoport. Sóként elsősorban alkálifém- cs alkáliföldfémsók jönnek számításba, továbbá fiziológiásán megfelelő savakkal, így sósavval, kénsavval, maleinsawal vagy ecetsavval képzett sók. 2 A találmány tárgyát képezi az az eljárás, amelynek segítségével ílirudo mcdicináiis férgek első feléből extrakcióval, kicsapással, membránszűréssel, és/vagy kromatográfiás eljárással tisztított hirudin-származékokat nyerünk ki. A nyers-extraktumok vérpiócából való kinyerésére szolgáló eljárást az Enzymology 5. kötet „Hirudin as an Inhibitor of Thrombin” c. fejezete ismerteti. A Hirudin nyers extraktum tisztítására a Bull. Soc. Chim. Biol. 45, 55 (1963) egy eljárást közöl. A találmány újdonsága, hogy a találmány szerinti eljárással nagy tisztaságú hirudin-származékokat magas hozammal nyerjük ki, vagy szintetizáljuk. A (II) általános képletű polipcpiid a (1) általános képletű hirudin-származékok olyan alesete, amikor a (1) általános képletben R jelentése H vagy —S03H Y jelentése Thr és m értéke 0. A találmány szerinti eljárásnál előnyösen alkalmazhatjuk a kicsapást, ultraszűrést valamint a megoszlásos kromatográfiás eljárásokat; c módszerekhez „reverz-fázis-anyagot”, így kovasavat használhatunk. De a nyers extraktum sajátságaitól függően egyéb kromatográfiás eljárás is számításba jöhet. A kromatografáláshoz alkalmas nyers-extraklum elkészítésénél a vérpióca fagyasztott első főiét felaprítjuk, majd vizes NaCl-oldulfal extraháljuk. Az oldhatatlan részt például rövid ideig tartó centrifugálással vagy gézen való szűréssel eltávolítjuk; az így kapott extraktumból a polipeptidet elkülönítjük. A kapott extraktumoi célszerű gyorsan 70 -90 °C-ra felmelegíteni, mert ily módon a proíeolitikus enzimek nagy része denaturálódik és kicsapódik. A kicsapódott anyagot például centrifugálással elkülönítjük. A kapott extraktumból elkülönítjük a fehérje frakciókat; a frakciók tartalmazzák a találmány szerinti pepiidet A pepiid elkülönítését úgy végezzük, hogy az extraktumot vízzel elegyedő szerves oldószerrel hozzuk össze. Erre a célra használhatunk például acetont; az oldószert az. extraktum térfogatára számítva hagy feleslegben, így például tízszeres mennyisében alkalmazzuk. A peptid lecsapását hűtés közben, célszerűen 0 és -40 °C közötti, előnyösen 0 cs -20 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A nagyobb molekulatömegű fehérjéket a nyers extraktumból például ultraszűréssel különíthetjük cl. Nagyobb mennyiségek esetében az ultras/.űrést két lépésben végezhetjük; az első lépésben olyan kapillárismembránt használunk, amelynek kizárási határa 500 000 Dalton, a második lépésben 10 000 Dalton kizárási határral rendelkező membrán-lapot alkalmazunk. A kapilláris-membrán segítségével nagy-molekulájú, a szelektív membránlap működését akadályozó anyagokat gyorsan elkülönítjük. Kis mennyiségek feldolgozása esetében az első lépést elhagyhatjuk. Másik megoldás szerint a kicsapást só hozzáadásával végezhetjük. Erre a célra használhatunk például ammónium-szulfátot. A megfelelő pH beállításával a kicsapást szelektívvé tehetjük. A találmány szerinti peptid izoelektromos pontja 3,9; így a pepiid 3 5 pH-nál előnyösen 4 pH-nál ammónium-szulfát hozzáadásával kicsapható. Az ammónium-szulfát-oldat kon5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
