198075. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vinblasztin konjugátumok és származékaik, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
15 198 075 16 foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk, A 4-[I-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-metil-butü-karbonil-oxi]-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keveijük és 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított ,Sephadex-G25 (2,6X96 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (180 ml), ultraszűrésscl koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 8,8 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra számolva. 21. példa 4-[2-( 2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-2-benzii-oxi-karbonil-oxi]-vinblasztin és galaktozilált humán albumin (HAgal) kapcsolása 105 mg 4-[2-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-2-benzil-oxikarboniI-etil-karbonil-oxi]-vinblasztint 7 ,9 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 226 mg HAgal-t 6,3 ml 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk."A 4-[2-(2,5-dioxo-3-pirroIin-l-il)-2-benzil-oxi-karboniietil-karbonil-oxi]-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátriumklorid oldatra (pH =7,5) beállított Sephadex-G25 (2,6X96 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. Akihajtott csúcsot összegyűjtjük (60 ml), ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 5,7 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra számítva. 22. példa 4\10f 2,5-dioxo-3-pirrolin -1 ■il)-dekanil-karboniloxij-vinblasztin és galaktozilált humán albumin (HAgal) kapcsolása 440 mg 4-[l0-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-dekanilkarbonil-oxi]-vinblasztint 46 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 969 mg HAgal-t 27 ml 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk. A 4-i.l0-(2,5-dioxo-3-pírroIin-l -il)-dekaníl-karbonil-oxi]-vinbíasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet 5 órán keresztül 40 °C hőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított Triszakril (5,6X50 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük (250 ml), ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 10,2 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra számítva. 23. példa 4-[ll -(2,5-dioxo-3-pirrolin-l -il)-undekanil-karboniloxi]-vinblasztin és galaktozilált humán albumin (HAgal) kapcsolása 120 mg 4-[l l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-undekanilkarbonil-oxij-vinblasztint 16 ml dioxánban oldunk. Ettől külön 339 ml HAgal-t 9,4 ml 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) oldunk. A4-[ll-(2,5-dioxo- 3-pirrolin-l -il)-undekanil-karbonil-oxiJ-vinblasztin oldatát a HAgal oldatához adjuk. Az elegyet 6 órán keresztül 40 °C hőmérsékleten keverjük, majd 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid oldatra (pH = 7,5) beállított Triszakril (5,6X50 cm) segítségével gélszűréssel tisztítjuk. A kihajtott csúcsot (240 ml) összegyűjtjük, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 9 mól alkaloidot tartalmazó 1 mól galaktozilált humán albuminra számolva. 24. példa 4-[l-(2,5-dioxo-3-pirro!in-l-il)-etil-karbonil-oxi]vinblasztin és nemspecifikus immunoglobulin (IgG) kapcsolása 4 mg 4-[l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-etil-karboniloxi]-vinblasztint 193 mikroliter etanolban oldunk. Ettől külön 10 mg IgG-t (626 mikroliter) 357 mikroliter 0,4 mól/liter foszfát-pufferben (pH = 8,5) és 447 mikroliter vízben oldunk (koncentráció 7 mg fehérje (ml). A 4-[l-(2,5-dioxo-3-pirrolin-l-il)-etil-karboniloxij-vinblasztin oldatát az IgG oldatához adjuk. Az elegyet 35 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül keverjük, majd 0,2 mól/liter foszfát-pufferre (pH = = 7,5) beállított Dupont de Nemours GF 450 4 250 oszlopon HPLC segítségével (gélszűrés) tisztítjuk. A kihajtott csúcsot összegyűjtjük és a mennyiségét meghatározzuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével és az alkaloidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 6,6 mól alkaloidot tartalmaz 1 mól immunoglubilinra számolva. A 17-24. példákban előállított konjugátunrok összetételét s kitermelését az 1. táblázatban adjuk meg. Az Összetételt a retenciós idő és a móltömeg alábbi összefüggése alapján nagynyomású folyadékkromatográfiás (MPLC) segítségével határozzuk meg. Retenciós idő és a móltömeg összefüggése Standard ' Retenciós idő Móltömeg IgM dimer (perc) 14,764 2X106 IgM pentamer 15,227 90X104 (THYRO) Thyroglobulin 15,944 66X104 (APÓ) Apoferritin 17,580 44X104 IgG 18,687 15X104 BSA (borjú szérum (albumin) 19,557 7X104 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
