197941. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A42125 jelű antibiotikum előállítására
197941 Az összegyűjtött telepek egynegyedével oltunk be 50 ml alábbi összetételű vegetatív tápközeget: glükóz 15 g tápióka dextrin* 20 g szója őrlemény 15 g kukoricalekvár 10 g élesztőkivonat 1 g kálcium-karbonát 2 g csapvíz 1 liter *Stadex 11, A.E.Staley Co., Decatur, IL, USA. Az oldat kémhatását nátrium-hidroxiddal pH=5,5—6,5 értékre állítjuk be. A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml-es Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 30°C hőmérsékleten, 5,08 cm kitérésű, 250 percenkénti fordulatszámú körkörös rázógépen, 72 órán keresztül. 1,25 ml vegetatív tenyészettel oltunk be 50 ml alábbi összetételű termelő táptalajt: 23 glükóz 25 g kukorica keményítő 10 g oldható húspepton* 10 g enzimmel hidrolizáit kazein** 4 g melasz 5 g magnézium-szulfát-7 víz 0,5 g kálcium-karbonát 2,0 g Czapek-féle sóoldat*** 2 ml ionmentes víz 1 liter *O.M.Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wi„ USA. **N-2 Amine A. ***A Czapek sóoldat az alábbi összetételű: 1 liter ionmentes vízben 100 g kálium-klorid, 100 g magnézium-szulfát-7víz, 2 g vas(II)-szulfát-7víz. A beoltott termelő táptalajt széles szájú, 250 ml-es Erlenmeyer lombikban rázatjuk 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen 250 percenkénti fordulatszámmal 30°C hőmérsékleten, 5 napon keresztül. B) A tankfermentáláshoz nagyobb menynyiségű oltóanyagra van szükség ezért 10 ml, az előzőekben ismertetett módon kinövesztett vegetatív tenyészettel beoltunk 250 ml második lépcsős növekedési táptalajt, melynek összetétele megegyezik a vegetatív táptalajéval. Ezt a második lépcsős tenyészetet kétliteres, széles szájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk, 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen 250 percenkénti fordulatszámmal 30°C hőmérsékleten, 70 órán keresztül. 400 ml második lépcsős tenyészettel beoltunk 100 liter steril termelő táptalajt, melynek összetétele azonos a rázott lombikos fermentálás termelő táptalajéval. A fermentálást 165 literes tankfermentorban végezzük 30°C hőmérsékleten, 3—5 napon keresztül. Lassú levegőárammal—0,12—0,25 térf./ /téri/perc — és közepes kevertetéssel — percenként 200—250-es fordulatszám — az oldott oxigén koncentrációját a levegőtelítettségi érték 30%-ánál tartjuk. 2. példa Az A42125 antibiotikum kinyeréséhez a teljes — 92 liter — fermentléhez hozzáadunk 3% Hyíio Supercelt és szűrőprésen leszűrjük. A 74 liter szürlet kémhatását nátrium-hidroxiddal pH=7 értékre állítjuk be. Hozzáadunk 9,4 1 Diaion HP-20 gyantát, a keveréket 45 percen keresztül kevertetjük és szűrjük. A szűrletet eldobjuk, a gyantát 3X10 liter vízben és 3X10 liter acetonitril/víz, 3:17 elegyben mossuk szuszpenzálással és szűréssel. A mosólevet eldobjuk. A gyantát acetonitril/víz, 1:1 elegyében szuszpendálva, kevertetve és szűrve, leoldjuk az A42125 antibiotikumot. Egymást követően négy elűciós műveletet végzünk, mindegyik eluátumot megvizsgálva. Papírkorongos teszttel, Micrococcus luteus teszt-organizmust használva. Az első két eluátumot egyesítjük, az acetonitrilt csökkentett nyomáson elpároljuk, és a vizes maradékot fagyasztva szárítjuk 94,9 g nyers A42125 antibiotikumhoz jutva. A harmadik eluátumból még 20,8 g nyers A42125 antibiotikumot kapunk. 3. példa A 2. példában leírt módon nyert nyers A42125 preparátumokat egyesítjük, a 115,2 g anyagot 3 liter vízben oldjuk. Az oldatból szűréssel eltávolítjuk a csapadékot, és a szűrletet 3 liter Dowax 50X2 (NH+ formában lévő 0,075—0,15 mm szemcseméretű gyantából készült oszlopra visszük. Az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi vízzel, majd 0,ln ammónium-hidroxiddal mossuk. A 2n ammónium-hidroxiddal végzett elúció legtöbb A42I25 antibiotikumot tartalmazó frakcióit egyesítjük és 3 liter térfogatra töményítjük. Az A42125 antibiotikum kicsapódik és szűréssel eltávolítjuk. A csapadékot 300 ml metanolban oldjuk, az oldathoz 6 liter étert adva, az A42125 antibiotikumot kicsapjuk. A csapadékot kiszűrve és megszárítva 16,6 g A42125 antibiotikumot nyerünk amorf por alakjában. A vizes anyalúgot tovább bepárolva, és a kicsapódó anyagot az előzőek szerint feldolgozva, 20,7 g kevésbé tiszta A42125 antibiotikumhoz jutunk. A 16,6 g első antibiotikum preparátumot 800 ml meleg vízben oldjuk, az oldatot hagyjuk szobahőmérsékleten állni egy éjszakán át. A kikristályosodó A42125 antibiotikumot szűréssel összegyűjtjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 10,6 g és 2,3 g (második generáció) kristályos A42125 antibiotikumhoz jutva. Op.: 149—150°C. 4. példa A szarvasmarhák számára módosított, kiegyensúlyozott, magas szemestakarmány tartalmú eleséget az alábbiak szerint állítjuk össze: kukorica 50,25% kukoricatorzsa 34,927% 24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
