197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 27 2. táblázat (folyt.) 28 Minta Hígítás T-limfocita sejtszám/ sej t/üreg/ Az IL-2 mennyiségé/egység/ml/ tápközeg-folyadékjának f eliilűszó j a/ mRNS transzlációs X2 88 32 termeke x X32 42 x mRNS a p3-16 plazmidból nyert cDNS-sel hidridizálva. 1 Egy másik cDNS „könyvtársat készítünk Land és munkatársai módszere szerint (Nucleic Acids Res. 9, 2551 (1981)), IL-2 mRNS-t alkalmazva templátként. Egyszálú cDNS-t (1,6 pg) szintetizálunk 4 pg IL-2 mRNS-t alkalmazva, amelyet dCMP gyökkel meghosszabítottunk; és ds-cDNS-t szintetizálunk oligo (dG),2-ig-at alkalmazva leolvasó mintaként (primerként) DNS polimeráz I-hez (Klenow-fragmens). A 680 bázispár DNS méretjellemzőnél hosszabb cDNS-t (0,6 pg) kinyerjük szacharóz gradiens centrifugálással és beiktatjuk a pBR322 PstI helyére standard G-C farokképző módszerrel. Az E. coli K 1776 transzformáció után rekombináns DNS-sel, mintegy 2000 telepet vizsgálunk át Grunstein-Hogness in situ hibridizációs módszerrel nick-transzlatált p3-16 cDNS inzerttel, mint vizsgáló mintával és a mintegy 850 bázispárt tartalmazó pIL2-50A plazmidot tartalmazó telepet és a transzformált kiónt (E. coli K 1776) pIL2-50A, AJ 11996 (FERM-BP-226) azonosítjuk. A pIL-2-50A cDNS inzert restrikciós endonukleáz hasítási térképét mutatja be az 1. ábra. Hogy a transzformált E. coli K 1776 pIL2- -50A-ból IL-2 pepiidet kódoló gént izoláljunk, plazmid DNS-t emésztünk PstI restrikciós enzimmel a sejtekből nyert DNS-terület izolálása után hagyományos módon. Az így létrehozott két DNS fragmens közül a kisebbik kialakított fragmens az IL-2 pepiidet kódoló DNS gén. A pIL2-50A-ból származó PstI inzert teljes nukleotid szekvenciáját Maxam és Gilbert eljárása szerint határozzuk meg (Maxam A. W. és munkatársai: Enzym. 65, 499— 560 (1980)), és a teljes szerkezetet mutatja be a 2. ábra. 2. példa A pKCR plazmid (O’Hare és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 3, 1527—1531) a következő részekből áll: (i) egy korai gén promotort és egy replikációs kiinduló-pontot (0,725—0,648 Morgan egység) és egy korai génből származó poliadenilációs helyet tartalmazó SV 40 DNS szegmens (vonalkázott szakaszaként bemutatva a 3. ábrában); (ii) a nyul ß-globin génjének egy része (nyitott szakaszként bemutatva) (BamHI-PvuII fragmens); (iii) egy replikáció kiinduló pontot és ampicillin rezisztencia gént tartalmazó 20 pBR322-bői származó szegmens (EcoRIIBamHI fragmens). Ezt a plazmidot BamHI- vel hasítjuk el és miután a hasított DNS mindkét végét kitöltöttük DNS polimeráz I-el (Klenow-fragmens), egy szintetikus PstI kötő 25 DNS-t vezetünk be, így hozva létre a pKCR (Pstl)-et. A pKCR (PstI) plazmidot Sáli-el elhasítjuk, Klenow-fragmenssel kezeljük, hogy kitöltsük a végeket, majd részlegesen elhasítjuk EcoRI-el, hogy EcoRI-Sall frag- 30 menst nyerjünk, amely tartalmazza az SV40- ből származott teljes.DNS-t és a globin gént. Ezt a fragmenst azután összekapcsoljuk a megfelelő enzimmel hasított pBR 328 DNS egy olyan darabjával, amely a tetraciklin 35 rezisztencia gént és a replikáció kiindulási pontját tartalmazza, amint ezt a 3. ábra körvonalazza. Az ilyen módon létrejött pCE-1 plazmid tartalmaz egy egyedi PstI helyet éppen az SV40 korai promotortól lefelé. A pIL2-50A cDNS inzertjét PstI hasítással elmetsszük és Pstl-hasított pCE-l-et kapcsoljuk össze, így hozva létre pCEIL-2-t, amelyben az IL-2 struktúrgén kifejeződése az SV40 korai promotor ellenőrzése alatt áll. A pCE-1 45 plazmidot eredetileg a cDNS klónozásához alakították ki a G-C farokképző módszerrel (Chang, A. C. Y. és munkatársai: Nature, 275, 617—624 (1978)) baktériumokban és közvetlen kifejeződéshez emlős sejtekben. 50 Ezt a plazmidot Hhal-el emésztjük, majd DNS-átvitellel (transzfekcióval) (McCutchan és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 41, 351—357 (1968)) a COS-7 transzformált ma- 55 jomsejtvonaiba vezetjük be, amely lehetővé teszi az SV 40 kiindulópont szekvenciát tartalmazó DNS replikációját, és amely Gluzman Y.-tól állt rendelkezésre (Cell, 23, 175—182 (1981)). Fontosnak látszik a Hhal plazmid emésztése az átvitel (transzfekció) előtt a cDNS hatásos kifejeződése érdekében, mivel azok a szekvenciák, amelyek gátolhatják az átvitt DNS replikációját a COS sejtekben, eltávolíthatók az ezzel az eljárással történő cDNS kifejeződéshez szükséges plazmidok 65 jelentős részéből. COS-7 sejteket (6Xl04/ml) 15
