197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
a pIN-II plazmidok előállítását. A B-beépítési hely esetén a B-l pIN-III plazmidot előállíthatjuk a pKEN221 jelű plazmidból oly módon, hogy a pKEN221 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Fnu4H-l restrikciós enzimmel emésztjük, és ezután EcoRI kohézív végeket kapcsolunk a kapott fragmens végeihez, és ezután EcoRI kohézív végeket kapcsolunk a kapott íragmens végeihez. Ezt az előzőekben megadottak és sematikusan a 17. ábra 138. számmal jelölt helyén ábrázoltak szerint végezzük. A kapott EcoRI fragmenst ezután Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, amikor a fragmens két részre válik az 5’-nem transzlatált szakaszon belül elhelyezkedő Xbal hasítási helynél. Az így kapott kisebb Xbal-EcoRI fragmenst tisztítjuk és kicseréljük a pYM061 (pIN-III, A-l) plazmid kisebb Xbal-EcoRI fragmensét, amiután B-l típusú autoregulált, indukálható klónozó hordozót kapunk. A kapott plazmid ezután tovább módosítható a 18. ábra 141. jellel jelölt helyén és a 19. ábrán, vagy a 18. ábra 142. jellel jelölt helyén és a 20. ábrán megadott módon, amiután B-2 és B-3 leolvasási fázisban lévő, megfelelő pIN-III plazmidokat kapunk. A pIN-III típusú C-helyet tartalmazó plazmidok közvetlen előállítására hasonlóképpen járhatunk el, anélkül, hogy először előállítanánk a megfelelő pIN-I vagy pIN-II plazmidokat. Ügy járunk el, hogy a pKENI 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sau3A restrikciós enzimmel emésztjük, és EcoRI kohézív végeket kapcsolunk a kapott fragmens végeihez (ezt a fentiekben megadottak és a 22. ábra 145. számmal jelzett helyén szemléltetett módon végezzük), a kapott EcoRI fragmenst ezután Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, amikor a fragmens az 5’-nem transzlatált szakaszon belül elhelyezkedő Xbal hasítási helynél két részre hasad. A szignál peptid szakaszt hordozó Xbal-EcoRI fragmenst ezután a pYM061 plazmid Xbal-EcoRI helyébe építjük be, így megkapjuk a pIN-III C-l típusú plazmidot. A 23. ábra 148. jellel jelzett helyén a 24. ábrán megadottak szerint, vagy a 23. ábra 149. jellel jelölt helyén és a 25. ábrán megadottak szerint eljárva, a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tovább módosíthatjuk, amiután megkapjuk a C-2, illetve C-3 leolvasási fázisban lévő pIN-III plazmidokat. A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns plazmid klónozó hordozókkal transzformált baktériumsejtekben humán hormon vagy más, polipeptid fejezhető ki, és ezekből jelentős mennyiség termelhető. A szakember számára érthető, hogy a leírásban megadott megvalósítási változatok csak szemléltető jellegűek, és nem limitálják az eljárást, és felhasználhatunk más, külső gének kifejezésére alkalmas rekombináns plazmid klónozó hordozókat is. 57 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás transzformált baktériumban legalább egy polipeptid kifejezésére alkalmas, klónozó hordozóként használható rekombináns plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy leolvasási fázisban összekapcsolunk egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán protein génjéből származó, legalább egy funkcionális fragmenst meghatározó dezoxi-ribonukleinsáv-szekvenciát (első DNS-szekvencia) — a lac promoter-operátor rendszert meghatározó valamely dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (második DNS-szekvencia), és — egy, az adott, legalább egy polipeptid aminosav-szekvenciáját meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (harmadik DNS-szekvencia), vagy egy transzlációs iniciációs kodonnal leolvasási fázisban kapcsolt, az adott harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia befogadására alkalmas beépítési hellyel, és — a lacl gént kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciával (negyedik DNS-szekvencia). 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális fragmensként egy promoter jelet tartalmazó fragmenst alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális fragmensként promoter jelet és 5’-nem transzlatált szakaszt tartalmazó fragmenst alkalmazunk. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy funkcionális fragmensként 3’-nem transzlatált szakaszt és transzkripciós terminációs jelet tartalmazó fragmenst alkalmazunk. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fu'nkcionális fragmensként konstitutív promotert tartalmazó fragmenst alkalmazunk. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az indukálható promotert a konstitutív promoter jeltől jobbra helyezzük el. 7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a konstitutív promoter jeltől, az indukálható promoter jeltől és az 5’-nem transzlatált szakasztól jobbra, míg a 3’-nem transzlatált szakasztól és a transzkripciós terminációs jeltől balra helyezzük el. 8. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett beépítési helyet a konstitutív promoter jeltől, az indukálható promoter jeltől és az 5’-nem transzlatált szakasztól jobbra, míg a 3’-nem transzlatált szakasztól és a transzkripciós terminációs jeltől balra helyezzük el. 58 197937 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 30
