197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 Legelőnyösebben azonban úgy járunk el, hogy a pIN-II kifejeződő plazmidok előállítására nem készítjük el a megfelelő pIN-1 plazmidokat. A B-beépítési hely esetén a pKEN051 (pIN-II, B-l) plazmid a pKEN221 plazmidból származtatható oly módon, hogy először Fnu4H-I restrikciós enzimmel emésztjük a pKEN221 plazmidot, és ezután a kapott fragmens végeihez EcoRI kohézív végeket kapcsolunk. Mindezt az előzőekben megadottak szerint és sematikusan a 17. ábra 138. hellyel jelölt helyén ábrázolt módon végezzük. Az így kapott EcoRI fragmens ezután Xbal restrikciós enzimmel emészthető, ekkor a fragmenst az Xbal hasítási helynél (ez az 5’-nem transzlatált régióba esik) két részre hasítjuk. Az így kapott kisebb Xbal-EcoRI fragmens tisztításával és a pKEN045 (pIN-II, A-l) kisebb Xbal-EcoRI fragmenssel való helyettesítésével megkapjuk a B-l indukálható klónozó hordozót. A kapott pKENOöl (pIN-II, B-l) plazmid ezután a 18. és 19. ábra 141 helyén és a sematikusan szemléltetett módon, vagy a 18. ábra 142. jellel jelölt helyén és a 20. ábrán sematikusan szemléltetett séma szerint tovább módosítható, amiután megkapjuk a B-2 és B-3 leolvasási fázisnak megfelelő pIN-II plazmidokat, nevezetesen a pKEN052 és pKEN053 plazmidokat. A pIN-II, C-helyet tartalmazó plazmidok közvetlen előállítására analóg módon járunk el, anélkül, hogy előzőleg előállítanánk a megfelelő pIN-I plazmidokat. Ügy járunk el, hogy a pKENI 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sau3A restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott fragmens EcoRI kohézív végeihez kapcsolunk (lásd az előzőekben megadottakat és a 22. ábra 145. jellel jelölt helyén ábrázoltakat), ezután az így kapott EcoRI fragmenst Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, az Xbal helyen két részre vágva ezzel a fragmenst (ez a hasítási hely az 5’-nem transzlatált szakaszon belül helyezkedik el). A szignál pepiid régiót hordozó Xbal-EcoRI fragmenst ezután beépítjük a pKEN045 Xbal-EcoRI helyére, amiután megkapjuk a pKEN054 (pIN-II, C-l) plazmidot. A pKEN054 dezoxi-ribonukleinsavnak a 23. ábra 148. helyén és a 24. ábra szerinti, vagy a 23. ábra 149. helyén vagy a 25. ábrán megadottak szerinti további módosításával megkapjuk a C-2 és C-3 leolvasási sémának megfelelő pIN-II plazmidokat, a pKEN055 és pKEN056 jellel jelölt molekulákat. E) Az autoregulált, indukálható kifejeződő (pIN-III) plazmidok előállítása A 28. és 29. ábrákon sematikusan szemléltetjük a pIN-II sorozatba tartozó indukálható A-l plazmid klónozó hordozók lacl génnel való kiegészítésének módszerét, amiután megkapjuk a megfelelő, pIN-III sorozatba tartozó, autoregulált, indukálható kifejeződő plazmidokat. Az alábbiakban az eljárás egyes lépéseit részletesen ismertetjük. 49 26 1) A pYM05l plazmid előállítása A pIN-III sorozatba tartozó A-l kifejeződő plazmidok előállításának első lépéseként a lacl gént klónozzuk a pBR322 plazmidba. A pFB140 plazmidból (ezt Riley-től kaptuk, Department of Biochemistry, State University of New York, Stony Brook) izoláljuk az 5,1 kb nagyságú, a lacl gént tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. Ügy járunk el, hogy 15 pg pFB140 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 80 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk 200 pl EcoRI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 2 órán át. A reakcióelegyet fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 12 egység PstI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztjük 300 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 6 mmól magnézium-klorid, 50 mmól nátrium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol literenként,és 100pg/ml borjú szérum albumin (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban Pstl-puffernak nevezzük). A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük 2 órán át. A lacl gént hordozó, 5,1 kb nagyságú Pstl-EcoRI fragmenst (sematikusan ábrázoljuk a 28. ábra 157. számmal jelölt helyén) agaróz gél-elektroforézissel tisztítjuk. A dezoxhribonukleinsav-fragmenseket, melyek az agaróz gélen vannak, 1 pg/ml koncentrációjú etidium-bromiddal festjük, és az 1,5 kb nagyságú fragmensnek megfelelő csíkot kivágjuk. A gélcsíkról fagyasztást követően eluáljuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket. A fragmensekről az etidium-bromidot fenolos extrakcióval távolítjuk el, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. Az 5,1 kb nagyságú, a lacl gént hordozó Pstl-EcoRI fragmens pBR322 plazmídba való klónozása érdekében a pBR322 PstI és EcoRI között fekvő kisebb dezoxi-ribonukleinsav-fragrr.enst a 28. ábra 158. számmal jelölt helyén megadottak szerint eljárva kihasítjuk. Ügy járunk el, hogy 10 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat két egység PstI restrikciós enzimmel hasítunk, 100 pl Pstl-pufferban. A reakciót 3 órán át végezzük, 37°C hőmérsékleten. Fenolos extrakciót követően etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután 80 egység EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, 200 pl össztérfogatú EcoRI-pufferban. A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. A 3,7 kb nagyságú nagyobb Pstl-EcoRI fragmenst ezután agaróz gél-elektroforézissel tisztítjuk. 0,07 pg tisztított fragmenst 0,1 pg előzőleg előállított, 5,1 kb nagyságú pFB140 fragmenssel keverünk, és a PstI és az EcoRI kohézív végeket összekapcsoljuk oly módon, hogy 20 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-li-50 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
