197931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas antitrombotikus aktivitású mukopoliszacharid kompozíciók előállítására
197931 USP-titer = 17 IU/mg YW-titer = 250 IU/mg b) Az a) résznél említett módon elkülönített kiindulási anyagból 40 g-ot feloldunk szobahőmérsékleten 400 ml desztillált vízben. A kapott oldat pH-ját 8—5-re beállítjuk 5N vizes nátrium-hidroxid-oldattal, majd 2 g kálium-permanganát 40 ml vízzel készült oldatát adjuk hozzá. Az így kapott reakcióelegyet 15 órán át intenzíven keverjük. A keverés során a pH-t folyamatosan 8,5 értéken tartjuk 5N vizes nátrium-hidroxid-oldat szükség szerinti adagolásával. 15 óra elteltével 90 ml etanolt adagolunk a reagálatlan kálium-permanganái redukálása céljából. A reakcióelegyet 5 órán át állni hagyjuk, majd mangán-dioxid csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. Ezután a terméket etanollal kicsapjuk, mossuk és szárítjuk. így 35 g mennyiségben 2,5-anhidro-D-mannózsav végcsoportokat tartalmazó terméket kapunk a következő jellemzőkkel- USP-titer = 12 IU/mg YW-titer = 750 IU/mg A 4. példában az 1. példa szerinti termékkel végzett farmakológiai tesztek eredményeit ismertetjük. 4. példa Az I. példa szerinti kompozíció in vitro aktivitása Az 1—4. ábrákon mutatjuk be azokat a görbéket, amelyeket kereskedelmi minőségű heparin és az I. példa terméke növekvő dózisainak alkalmazásával emberi vérplazmában az alvadási idő változásának in-vitro tanulmányozásánál kaptunk. A 3. és 4. ábrába foglalt eredményeknek megfelelő kísérleteknél vérlemezkéktől mentes és a XI. faktorban dúsított plazmát használtunk. Ezek az ábrák mutatják a thrombin (1. ábra), cephalin-kaolin (2. ábra), koncentrált thromboplastin jelenlétében bekövetkező koagulódás (3. ábra) és híg thromboplastin (4. ábra) szekundumokban kifejezett változásait, amelyeket a konkrét esetekben megfelelő dózisokban felhasznált kísérleti termékek azaz az 1. példa szerinti termék (al, a2, a3 és a4 görbék) és a heparin (b 1, b2, b3 és b4 görbék) váltottak ki. Mind a thrombin-idők, mind a cephalin-kaolin idők olyan típusú méréseket reprezentáltak, amelyek elsősorban az aktivált II. faktor és a teljes koaguláció vonatkozásában kifejtett inhibitá lás tanulmányozására alkalmasak. Az 1. és 2. ábrák szerinti görbék tanulmányozása azt mutatja, hogy a találmány szerinti eljárással előállított mukopoliszacharidok a heparinénál határozottan csekélyebb hatásúak a prothrombin aktivitásának gátlásában és a teljes koaguláció szintjének gátlásában. A 3. és 4. ábrákon (amelyek reprezentatívak az extrinsic koagulálációra jellemző enzimatikus 6 9 reakciók sorrendjével közvetlenebbül összefüggő jelenségek, különösen a Xla faktor relatív hiánya vonatkozásában) látható a találmány szerinti eljárással előállított mukopoliszacharidok előnyös hatása a heparinéhoz képest. Az 5. példában a 2. példa szerint előállított mukopoliszacharidoknak nyúlon in vivo végzett kísérletekben kifejtett hatását ismertetjük. 5. példa A 2. példa szerint előállított termék antitrombotikus aktivitásának tanulmányozása nyúlon 500 egység YW adagolása nyúlnak jelentős anti-Xa aktivitást eredményez, míg az ossz antikoaguláns aktivitás viszonylag alacsony marad. A beadás után 2 órával az YW aktivitás 0,88 egvség/m! nagyságrendű, míg a cephalin-kaolin idő 0,09 IU/ml. Az in vitro és in vivo vizsgálatok tehát egyértelműen megmutatják a találmány szerinti eljárással előállított mukopoliszacharidoknak a heparinénál lényegesen szelektívebb hatását, különösen az Xa faktor gátlásának szintjén. 6. példa Ant ibiotikus aktivitástól gyakorlatilag mentes mukopoliszacharid-frakciók előállítása Az I. példa szerinti oldható frakciót elkülönítjük. Ez a frakció 2—14 egységből álló láncokat tartalmaz. Ha ezt a frakciót járulékos alkoholos fakcionálásnak vetjük alá, egyrészt egy csapadékot (ezt elkülönítjük) és egy oldható frakciót kapunk, és az utóbbiból különítjük el az y kompozíciót. Ez a kompozíció legfeljebb 6—8 egységet tartalmazó láncokból áll. YW-titere kisebb, mint 70 és USP-titere kisebb, mint 5. Ha az y kompozíciót gélszürésnek vetjük alá szokásos módon, akkor antikoaguláns aktivitástól mentes z, hexoszacharid-kompozícíót kapunk. Ezek a kompozíciók gátolják a neonangiogenezist. 7. példa Az y és z kompozícióknak neoangiogenezisre kifejtett aktivitása Az anti-angiogenezissel kapcsolatos in vitro kísérleteket csírkeembrió chorioallantoid membránjával petri-csészében készített 6 napos tenyészeten végezzük el. Pelleteket készítünk úgy, hogy 5 pg hidrokortizont 10 ul metil-cellulózzal keverünk öszsze, majd a keverékhez 5 pg és 100 pg között váltakozó mennyiségekben az j és a z kompozíciókat adjuk. Az így kapott pel leteket megszárítjuk, majd a chorioallantoid membránra helyezzük, amelyhez hozzátapadnak. Mindegyik kísérlethez négy tojást használunk. 48 órás inkubálás elteltével avaszkuláris zónák észlelhetők és a vaszkuláris zónákban jelentős csökkenés tapasztalható. Ezek az eredmények elérhetők figyelemre méltó módon már 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
