197927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás opiát receptor specifikus affinitás-jelölő omega-halogén-metil-tetrapeptid-származék előállítására
197927 hozzá. 2 mg HClXMePhe-CH2Cl aminosav^-klórmetil-ketont feloldunk 200 pl tetrahidrofuránban; —10°C-ra hűtjük, majd hozzáadunk 8 pmól N-metil-morfolint (30 pl THF-ben oldva). A két oldatot összeöntjük és 0°C— 5°C-on, 1 órán át kevertetjük. A nyers termék összetételét vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk, szilikagél (Merck) lapokat és kloroform-metanol-ecetsav (80:10:5) és etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (80:6,6:2:3,66) rendszereket használunk. A vékonyréteg lapokon a radioaktivitás helyét Packard Radiochromatogram Scanner-rel mérjük. A radioaktivitás 90%-a a védett tetrapeptid-klór-metil-ketonhoz rendelhető. Rf értékek: 0,67 és 0,57. A nyers terméket kloroform-metanol-ecetsav (80:10:5) rendszerben 20X20 cm-es szilikagél lapon tisztítjuk. Medifort RP röntgenfilmen 1 órás exponálás után autoradiográfiásan jelöljük ki a védett tetrapeptid-klór-metil-keton helyét. A megfelelő sávot lekaparjuk és a szilikagélről 4X2 ml spektroszkópiai alkohollal oldjuk le az anyagot. Radioaktivitás: 1,73 GBq. 3H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-CH2CI előállítása 751 MBq védett tetrapeptid-klór-metil-ketont 0,5n sósavas ecetsav oldatban oldunk és 20 percig állni hagyjuk. Az oldat lepárlása után még kétszer 2 ml metanolt párolunk le. A nyers terméket vékonyréteg-kromatográfiával tisztítjuk, szilikagél lapot és kloroform-metanol (80:24) futtatórendszert alkalmazva. Autoradiográfia segítségével jelöljük ki a rétegen a termék helyét és ebben a sávban a szilikagélt lekaparjuk. A leoldást 5X2 ml etanollal végezzük. 546,5 MBq 3H-tetrapeptid-klór-metil-ketont kapunk. A tisztítás után a termék tisztaságát vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük. Szilikagél lapon kloroform-metanol (80:24) rendszerben az R/ érték: 0,36. A termék homogén. A tisztított tetrapeptid-klór-metil-keton mennyiségét UV-spektrumának felvételével határozzuk meg. Előzőleg meghatározzuk standard segítségével a 3H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-CH2Cl moláris extinkciós koefficiensét (1720 cm2/mól) és ennek felhasználásával a triciált termék mennyisége 0,3 pmól-nak adódik. A radioaktivitásból és a mennyiségből a termék moláris aktivitása: 1,8±0,074 TBq/mmól. A 3H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-CH2Cl peptid klór-metil-keton szobahőmérsékleten bomlik. Ezért fontos, hogy híg oldatban (37 MBq/cm3) cseppfolyós nitrogén hőmérsékletén tároljuk. Ilyen körülmények között 3 hónapig bomlás nélkül tárolható. További tárolás esetén a triciált pepiidet használat előtt tisztítani kell. Előnyös, ha a peptidet/terc-butiloxi-karbonil védőcsoporttal ellátott formában tároljuk. Ebben az esetben —60°C-on is tárolható. Ekkor a használat előtt el kell távolítani a védőcsoportot. 7 A találmány szerinti vegyületek biológiai hatásait az alábbiakban, a DAMK, mint reprezentatív anyag példáján ismertetjük. IÍI. Inaktív DAMK biológiai tesztje á) agonosta sajátság b) nagy affinitás c) mu altípus szelektivitás d) az opoid receptorokhoz való irreverzibilis kötődés A DAMK hatásait in vitro rendszerben, receptorkötési módszerrel (Neurochem. Rés. 10, 627, 1985. és J. Neurochem 43, 957, 1984) vizsgáltuk. A kötési kísérleteket patkány (PVG/C törzs) agy membránpreparátumon végeztük, amelyet (Mol. Pharm. 11,340, 1975) szerint készítettünk. A receptorok jelölésére 3H-naloxont (antagonista, 73 Ci/mmól) J. L.abell. Comp. Radiopharm. 19, 1021, 1982), 3H-DALE-t (delta agonista, 37 Ci/mmól, Neurochem. Rés. 10, 627, 1985), 3H-dihidromorf nt (mu agonista, 68 Ci/mmól, Radiochem. Rádiónál. Letters 56, 209, 1982), 3H-DAGO-t (mu agonista 45 Ci/mmól, Amersham) és 3H - etilketociklazolint (kappa agonista, 18 Ci/mmól, NEN) használtunk. Az összes reagens analitikai tisztaságú volt. Az inkubációs elegy térfogata 1 ml volt. A reakcióelegy 100 uL radioligandot, 100 uL \izet vagy vizsgálandó jelöletlen ligandot és 800 uL (0,3—0,5 mg/mL protein) membránfehérjét pH=7,4 Tris pufferben tartalmazott. A kötési reakciót a membránfehérje hozzáadásával indítottuk és az inkubáció végén vákuum alatti gyors szűréssel (Whatman GF/B és GF/C üvegszálas filter) állítottuk le. A nem kötődött radioligandot pufferes mosással távolítottuk el. A filterek radioaktivitását toluolos koktélban LKB Minibeta folyadékszcintillációs számlálóval mértük. A nem specifikus kötést 10 pM jelöletlen (nem radioaktív) ligand jelenlétében határoztuk meg. A specifikus (receptorális) kötést az összes (csak radioligand jelenlétében mért) és nem specifikus (radioligand-j-jelöletlen ligand) kötés különbségeként definiáltuk. a) A DAMK agonista jellegének meghatározása Vizsgáltuk a DAMK kötődési sajátságait 3H-naloxonnal (antagonistával) jelölt endszerben. A triciált ligand koncentrációja 2 nM volt. A DAMK koncentráció-függő módon gátolta a specifikus 3H-naloxonkötést. A dózishatás-görbéből meghatározható a specifikus kötés 50%-os gátlásához szükséges ígandkoncentráció (IC50 érték), amely az adott ligand affinitására jellemző. Na+ ionok (100 mM koncentrációban) jelenlétében az opiát agonisták affinitása lecsökken (az IC50 aő), az antagonistáké lényegében változatlan marad (Mol. Pharm. 11, 735, 1975, J. Pharm. Exp. Ther. 192, 531, 1975). A Na+ ionok jelenlétében és távollétében mért IC50 értékek hányadosa (Na+index) antagonisták esetében 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
