197880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-hidroxi-4-(szubsztituált alkenil)-ciklohexán-karbonsav származékok előállítására
197880 hányszor átmostuk, majd ismét 1 pM Indomethacint adtunk mindegyik fürdőhöz, öt perc múlva az egyes fürdőkhöz hozzáadtuk a vizsgált vegyületet vagy a hordozóanyagot. 15 perc múlva egyre növekvő koncentrációjú leukotrién D4 oldat alkalmazásával előállítottuk a koncentráció-válaszgörbéjét, s ezt azután összehasonlítottuk a kezdeti maximális összehúzódással. A vizsgált vegyületet akkor tekintettük hatásosnak, ha 100 pM-ig terjedő koncentrációban szignifikáns (jelentős) jobbratolódást hozott létre a leukotrién Dr oldatra adott koncentráció-válaszgörbén. Az antagonista hatást a pA, értékkel határoztuk meg, melyet az Arunlakshana és Schild (Brit. J. Pharmac. Chemotherap. 14; 48, 1959) által leírt módszerrel számítottunk. A 3H-LTD4 specifikus receptorkötés tengerimalac tüdőmembránban Elpusztított hím tengerimalacok tüdejét eltávolítottuk, és 50 mM jéghideg, 7,4 pH értékű Tris-sósav pufferoldatba helyeztük. A tüdőket ezután Politron készülékkel homogenizáltuk, majd a homogenizátumot 10 percen át 4°C-os hőmérsékleten, 1000 g gyorsulással centrifugáltuk. Ezután a felül úszó folyadékot 10 percen át 4°C-on 30000 g-vel centrifugáltuk, így pelletek alakjában kaptuk meg a membránt. Ezt a pelletet azután 50 mM Tris-sósav pufferoldatban újra elszuszpendáltuk, így megkaptuk a vizsgálatokhoz használandó tüdőmembrán-szuszpenziót. A kötési vizsgálatokat 50 mM 7,6 pH-jú Tris-sósav pufferoldatban, 37°C-os, 20—40 perces inkubációs periódusok alkalmazásával végeztük. A kötött és a szabad állapotú 3H-LTD4-et Whatman GF/B üvegszövet szűrőn történő gyors átszűréssel, jéghideg Tris-sósav puffer és 3x4 ml mosó-oldat alkalmazásával választottuk el egymástól. A szűrést és a mosást 8 másodpercnél rövidebb idő alatt végeztük el, majd megmértük a szűrők radioaktivitását. A 3H-LTD4 specifikus kötődését úgy határoztuk meg, hogy a 3H-LTD4-nek a jelöletlen LTD4 nélkül mért kötődési értékéből kivontuk a 2xl0~7 M jelöletlen LTD4 jelenlétében mért kötődési értéket. A 3H-LTD4 specifikus kötés az összes kötés 60—80%-át tette ki. A vizsgált vegyületekkel folytatott tanulmányok kimutatják, hogy e vegyületek gátolják a 3H-LTD4 specifikus kötődését. E vizsgálatok során a reagenseket egyre nagyobb koncentrációban alkalmaztuk a 3H-LTD4 specifikus kötésének blokkolására. Azt a koncentrációt, mely a 3H-LTD4 specifikus kötődését 50%-ra csökkenti, ICS0 értéknek nevezzük. Az alábbi táblázatban megadjuk néhány, a találmány szerinti eljárással előállított és a fent leírt módszerrel vizsgált vegyület specifikus hatását. A hatásosság azonban változó, és úgy tűnik, hogy a táblázatban szereplő vegyületek hatása a tetradecilidén-származékok R-alkil-csoportjának hosszával párhuzamosan csökken. 5 4 Vegyület Tengeri malac Tengeri malac 6 A példa zárna) lágyék pÄ2 (LTD,*) tüdő specifikus kötődés IC5 o > JuM 10D 9,8-10H 9,61 8,7 10F 9,42-1 1 7,87-10J 8,26 7,1 10L 8,57 8,0 In vivo biológiai hatás A találmány szerinti módon előállított vegyületeket in vivo is vizsgáltuk a leukotrién D4 antagonista hatás szempontjából, érzéstelenített tengeri malacokon, módosított Konzett-Rössler készítmény alkalmazásával. A tengenmaiacokat n átrium-pen tobarbitallal érzéstelenítettük, majd sebészetileg előkészítettük őket egy állandó térfogatú lélegeztető készülékkel fenntartott mesterséges légzésre. A tengerimalac tüdejének minden egyes belégzésekor mértük a lélegeztető készülékben fellépő nyomást. Ha a belégzési nyomás az alapvonal fölé emelkedik, az tüdőszűkületet (bronchoconstriction) jelez. Miután meghatároztuk a belégzési nyomás alapvonalát, a tüdőszűkületet 50 vagy 100 ng/kg leukotrién D4 beadásával idéztük elő. Az erre adott reakciót tekintettük a kezdeti reakciónak. Miután a belégzési nyomás visszatért az alapvonalhoz, a tengerimalacot a vizsgált vegyület vagy hordozóanyag intravénásán (i. v.) vagy intraduodenálisan (i.d.) beadott kívánt mennyiségével, majd az intravénás beadás után 1 perc, ill. az intraduodenális beadás után 5 vagy 20 perc múlva leukotrién D4 beadásával kezeltük. Az így kapott reakciót azután a kezdeti reakcióval összevetve kiszámítottuk a %-os hatást. Az eredményeket az alábbi módon összegeztük, mert a kapott kétféle eredmény közül az i. d. módon történő beadással kaptuk a nagyobb inhibíciós (gátlási) értékeket. Vegyület Dózis Mód- Inhibí-(A példa szama) szer ció 10F 0,0002 mg/kg i.v. 38 10F 0,002 If 11 52 10F 0,02 IT II 94 10F 0,1 If i.d. 74 10F 0,2 II 11 93 10J 0,5 II 11 48 10J 1,0 f! II 53 101 0,05 11 i.v. 19 10L 0,5 11 II 74 10L 1,0 II i.d. 25 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
