197773. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-vinil-penam származékok előállítására
1 A találmány tárgya eljárás új penicillinTantibiotikum intermedier előállítására. Az eljárás során enzimatikusan az izopenicillin-N-szintetáz segítségével egy N-terminális vinil-szubsztituált tripeptidet 2-metil-2-vinil-penammá alakítunk. A termékből 6-(acil-amino)-2-metil-2-vinil-penam-3-karbonsavat állíthatunk elő. Az izopenicillin-N-szintetáz enzim közismert módon képes a ő-(L-a-amino-adipoil)-L-ciszteinil-D-valin tripeptidet izopenicillin-N-né ciklizálni. Az enzim számos forrásból, így Penicillin, chrysogenum, Cephalosporium acremonium és Streptomyces clavuligerus kultúrákból nyerhető, és sejtmentes extraktum formájában hasznosítható. A penicillinek és más ß-laktäm típusú antibiotikumok terápiás fontossága miatt komoly erőfeszítéseket tettek ezen szintetáz ß-laktäm típusú vegyületek előállításában játszott szerepének tisztázására. A leírtaknak megfelelően az izopenicillin-N-szintetázt egy N-terminális vinil-szubsztituált tripeptid 2-metil-2-vinil-penammá történő átalakításához alkalmazzuk. A ő- (L-a-amino-adipoil) -L-ciszteinil-D-y-6-didehidro-izoleucin tripeptidet vas (II) -ion és oxigén jelenlétében izopenicillin-N-szintetázzal inkubáljuk 6ß-(L-a-amino-adipoil-amino)-2ß-metil-2a-vinil-penam-3-karbonsav előállítása céljából. A 2-vinil-penamból ismert dezacetilezési eljárásokkal állíthatjuk elő a 2-viniI-penam vázat tartalmazó 6ß-amino-2ß-metil-2a-vinil-penam-3-karbonsavat. A találmány szerinti enzimatikus eljárás során az (A) képletű tripeptidet vagy alkálifém vagy alkáliföldfém sóját izopenicillin-N-szintetáz enzimmel (IPNS) vizes közegben oxigén és vas(II)-ion jelenlétében 20°C—40°C hőmérsékleten pH =6—9 közötti tartományban inkubáljuk a (B) képletü 2-vinil-2-metil-penam vegyület vagy annak alkálifém- vagy alkáliföldfém sója előállítása céljából. Ezek a sók lehetnek például a nátrium, kálium és kálcium sói. A tripeptid szubsztrátot általában kb. 5 mmól-os koncentrációig alkalmazzuk, azaz kb. 0,1 mmól—5 mmól tartományban. A tripeptidet nehéz szabad tiol formájában előállítani és tartani, mivel könnyen stabil diszulfiddá oxidálódik. A diszulfidot azután közvetlenül a reakcióban történő felhasználás előtt tiollá redukáljuk megfelelő redukálószerek, például ditioltreitol, ß-merkaptoetanol, glutation vagy egyéb felhasználásával. Az enzimet előnyösen a szubsztrát menynyiségéhez képest nagy feleslegben alkalmazzuk. A felesleg mennyiségét az illető IPNS készítmény enzimatikus aktivitásának meghatározásával mérhetjük. Az enzim aktivitását aktivitásegységekben fejezhetjük ki, ahol egységnyi aktivitás alatt azt a ml-kénti aktivitást értjük, amely 1 pM/ml szubsztrát termékké alakításához szükséges. A jobb eredmények érdekében tisztított enzimeket, például Pang és munkatársai által a Biochem J. (1984), 222, 789—795; és J.E. Bald-2 win és munkatársai által a FEBS LETTER, 1985, 188, 253 számában közölt módon, használunk az eljárásban. Az eljárás különböző forrásokból származó, kevésbé tiszta enzim készítményekkel is megvalósítható, például az enzim sejtmentes extraktuma állítható elő Hollander és munkatársai szerint (Science, 224, 610—612.) Cephalosporium acremonium ATCC 48272-ből, vagy Penicillium chrysogenum, Aspergillus mdulans, Streptomyces lipmanii és Streptomyces lipmanii és Streptomyces clavuligerus kultúrákból. Az enzim célszerűen tisztítható. Az eljárást vas(II)-ion és aszkorbinsav jelenlétében hajtjuk végre. Ezen tényezők jelenlétében az enzim, mely oxidázként működik kifejti maximális aktivitását. Általában az enzim aktiválásához szükséges minimális menynyiségű vas(II)-iont alkalmazzuk, a vas(II)-ion koncentrációja rendszerint 50 pM és 0,2 pM között van. Az IPNS tisztaságának növekedésével kisebb koncentrációjú vas (II)-ion szükséges az aktivitáshoz, és fordítva, féligtisztított enzim alkalmazása esetén nagyobb vas-ion koncentráció szükséges. A vas -ionok aszkorbinsavval együtt alkalmazva akí válnak a legjobban. Általában az aszkorbinsavat a Fe2^ ionok koncentrációjával megegyező, vagy annál nagyobb koncentrációban alkalmazzuk. Vas (II)-ionokat nyerhetünk megfelelő vízoldhatóságú, a vizes inkubációs elegyben a kívánt koncentráció elérését biztositó vas-sókból, mint például vas-szulfát, vas-klorid, vas-karbonát vagy egyéb megfelelő Fe2+ források. Az eljárás során hidrogén-peroxid képződhet, így egy kataláz enzim, például marhamáj kataláz adható az inkubációs elegyhez a többlet peroxid szint elkerülése érdekében. Magas peroxid szint ugyanis ártalmas lehet az enzimre vagy a szubsztrátumra. Az eljárást oxigén jelenlétében, az inkubációs elegy kevertetése vagy rázatása közben hajtjuk végre. A megfelelő oxigénellátást biztosítja, ha az eljárást egy nyitott lombikban végezzük, azonban nagy szubsztrátkoncentráció és nagy enzimfelesleg esetén előnyös lehet az eljárás során direkt oxigén bevezetés alkalmazása. Tisztított enzim felesleg alkalmazása gyorsítja a folyamatot, általában az eljárás kb. 10 perctől kb. két óráig terjedő idő intervallumban végbemegy, de előnyösen 45—60 percet vesz igénybe. Meg kell jegyeznünk, hogy nagyobb mennyiségű szubsztrát és enzim inkubálása esetén az eljárás végbemeneteléhez va'amivel hosszabb idő szükséges. Az inkubációs elegyet puffer segítségével pH = 6—9-es értéken tartjuk, előnyösen pH = -= 7,5—8,6 közötti értéken. Megfelelő pufferek ‘öbbek között az ammónium-hidrogénkarbolát, trisz-puffer és MOPS (3-morfolino-propán-szulfonsav. Az eljárás 20°C és 40°C közötti hőmérséklettartományban vihető végbe, de az előnyös hőmérséklet 25°C és 30°C között van. 197773 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
