197768. lajstromszámú szabadalom • Eljárás TAN-749 antibiotikumok, és hatóanyagként ezen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197768 Nutritive Chemicals, Japán) és 0,3% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldathoz (pH 7,0) 0,5% kalcium-karbonátot adunk —, és a tenyészetet 24°C-on 48 órán át lengő rázógépen rázatjuk. A kapott tenyészet teljes mennyiségét 50 l-es fermentorba visszük át, amely 30 l tápkőzeget tartalmaz, a tápkőzeget úgy állítjuk elő, hogy a fenti táptalajhoz 0,5% Actcol (Takeda Chemical Industries, Japán) habzásgátlószert adunk. A tenyésztést 24°C-on 30 l/perc levegőztetés és 200 fordulat/perc mellett 48 órán át folytatjuk. A kapott tenyészet 6 l-ét 200 l-es fermentorba oltjuk át, amely 120 I 3% glicerint, 0,1% glükózt, 0,5% polipeptont, 0,5% húskívonatot (Wako Pure Chemical Industries, Japán), 0,5% nátrium-kloridot, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 2 p-g/ml kobalt-kloridot és 0,05% Actolt tartalmaz, majd a tenyésztést 24°C-on 66 órán át folytatjuk, 120 l/perc levegőztetés és 170 fordulat/perc keverés mellett. A kapott 105 1 tenyészet pH-ját 2 n sósavoldattal 6,5-re állítjuk, majd Hyflo Super Cel (Johns Manville Product, USA) szűrési segédanyaghoz adjuk és szűrjük, a mosást vízzel végezzük. A kapott 102 liter szűrlet pH-ját, 6,5-re állítjuk, és 2 1 IRC-50-nel (Na+-típus) töltött oszlopon folytatjuk át. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 500 1 2 mól/1 koncentrációjú sóoldattal eluáljuk. A kapott eluátumot 2 I aktívszénnel töltött oszlopon folytatjuk keresztül, az oszlopot vízzel mossuk, majd 15 1 8% butanolt tartalmazó vízzel eluáljuk. A kapott eluátum pH-ját 6,2-re állítjuk, térfogatát 2 1-re koncentráljuk és 0,5 1 CM-Sephadex C-25-teI (Na+-típus) töltött oszlopon folytatjuk át. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat 20 1 0,1 mól/1 koncentrációjú sóoldattal eluáljuk (1—41. frakció). A TAN-749B-t tartalmazó frakció eluálódik hamarabb, (10—12. frakció), míg a TAN-749A-t tartalmazó frakció később eluálódik (13—18. frakció). A kapott frakciókat 1,0 1, illetve 4,0 1 aktivált csontszénen kromatografáljuk, és az eluátumot sómentesítjük, majd koncentráljuk és liofilizáljuk. 4,0 g TAN-749B, illetve 8,9 g TAN-749A nyersterméket kapunk. A 4,0 g TAN-749B nyersterméket ezután fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, hordozóként YMK-PAK S-30-at (Yamamura Chemical Laboratories,, Japán), mozgó fázisként 8% metanolt tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszforsavoldatot (pH 3) használunk. A kapott, kívánt terméket tartalmazó frakciókat 0,25 1 CM-Sephadex C-25-tel (Na+-típus) töltött oszlopon kromatografáljuk, majd 0,3 1 aktívszénnel töltött oszlopon tisztítjuk. A kapott tiszta frakciót koncentráljuk és liofilizáljuk. 0,66 g TAN-749B-di(hidrogén-klorid)ot kapunk, fehér por formájában, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel. A 8,9 g TAN-749A nyersterméket a fentiek szerint tisztítva 4,7 g tiszta TAN-749A-di(hid-17 10 rogén-klorid)-ot kapunk, fehér por formájában, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel. 2. példa Komplett ferde agaron tenyésztett Pseudomonas fluorescens YK-437 (IFO 14446, FERM BP-1005) törzset 2 literes Sakaguchi-lombikban lévő 500 ml tápközegbe oltunk — amelyet úgy állítunk elő, hogy 2% glükózt 3% oldható keményítőt, 1% szójalisztet, 0,3% kukoricalekvárt, 0,5% polipeptont, és 0,3% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldathoz (pH 7,0) 0,5% kalcium-karbonátot adunk —, és a tenyészetet 24°C-on 48 órán át lengő rázógépen rázatjuk. A kapott tenyészet teljes menynyiségét 200 literes fermentorba visszük át, amely 120 liter tápközeget tartalmaz, amelyet úgy állítunk elő, hogy a fenti táptalajhoz 0,05% Actcolt adunk. A tenyészetet 24°C- on 120 l/perc levegőztetés és 180 fordulat/perc keverési sebesség mellett 48 órán át inkubáljuk. A kapott tenyészet 50 literét 20000 literes, 1200 liter táptalajt tartalmazó fermentorba oltjuk át, a tápközeg 3% glicerint, 0,1% glükózt, 0,5% polipeptont (Daigo Nutritive Chemicals, Japán), 0,5% húskivonatot (Wako Pure Chemicals, Japán), 0,5% nátrium-klondot, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 2pg/ml kobalt-kloridot és 0,05% Actcolt tartalmaz. A Tenyésztést 24°C-on 66 órán át folytatjuk, i 200 l/perc levegőztetés és 150 fordulat/perc keverési sebesség alkalmazása mellett. A kapott 1150 liter tenyészet pH-ját 6,5-re állítjuk, majd Hyflo Super Cel-hez (Johns Manville Product, USA) adjuk, szűrjük, vízzel mossuk, és a kapott 1220 liter szűrlet pH-ját 6,2-re állítjuk, majd 20 liter IRC-50- nel (Na+-típus) töltött oszlopon folytatjuk át. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 200 liter, 0,5 n hidrogén-klorid-oldattal eluáljuk. A kapott eluátum pH-ját 5,6-ra állítjuk, majd 20 liter Diaion SP-207-tel töltött oszlopon folytatjuk keresztül, és 120 liter vízzel eluáljuk. A kapott eluátumot 2 literre koncentráljuk, és a koncentrátumot 3 liter CG-50-nel (NH4+-*ípus) töltött oszlopon folyatjuk keresztül. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat 40 1 0,4—0,6 mól/1 koncentrációjú fóoldattal eluáljuk (1 —15. frakció). A TAN-749A, B, C és D tartalmú frakció e'uálódik hamarabb (4—9. frakció), és egy TAN-749A tartalmú frakció eluálódik később (10—14. frakció). Minden egyes kapott frakciót kromatográfiás tisztításnak vetünk alá, az oszlopot 1,2 liter, vagy 2,0 liter aktívszénnel töltjük meg, és az eluálást 8% izobutanolt tartalmazó vizes oldat 4, illetve 10 literével végezzük. A csak TAN-749A-Í tartalmazó frakciókat koncentrálva és liofilizálva 47,5 g TAN-749A-t kapunk, di(hidrogén-klorid)-só formájában, amelynek fizikai állandói azonosak a leírás első részében közöltekkel. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
