197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
A találmány tárgya humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzése. A találmány foglalkozik a humán H2 relaxin, prorelaxin és preprorelaxin előállításával is. 17906/83 számú ausztrál szabadalmi bejelentésünkben (PF 5352/82, bejelentés napja 1982. aug. 12.) leírtuk a humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozását és jellemzését. Most találtunk egy másik gént, amely szintén kódol humán relaxint. Pontosabban ennek a találmánynak a tárgya a prorelaxint, preprorelaxint és a humán relaxin A és/v.agy B és/vagy C peptid láncait kódoló izolált és tisztított (azaz „klónozott") humán gén, a gének izolálási és tisztítási módszerei, és módszer a gének átvitelére a gazdasejtbe és a gének replikálására a gazdasejtben. A klónozott géneket a gazdasejt akkor fejezi ki, amikor kapcsolódik egy gazdasejtben kifejeződni képes prokarióta vagy eukarióta génnel. A gének így használhatók a gyógyászati célokra alkalmas humán relaxin előállításához. A találmány tárgyához tartoznak a humán relaxin és prorelaxin peptidek, valamint az egyes peptid láncok, amelyek tartalmazzák ezeket a szekvenciákat és ezeknek a peptideknek a módosított formáit. A találmány tárgyához tartoznak még azok a módosított gének, amelyek az egyes relaxin-láncokat és a fentemlített módosított formájú peptideket kódolják. Hisaw, F.L. úttörő munkája (Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 23, 661—663 (1926)) vetette fel a relaxin peptid fontos szerepét az emlősökben, amely az ágyéktáji szimfizis tágító hatása révén jelentkezik, ilyen módon könnyítve meg a szülési folyamatot. A relaxin a petefészkek sárgatestjében képződik és tárolódik a terhesség folyamán, és a véráramban a szülés előtt kerül. A rendelkezésre álló petefészkek lehetővé tették a relaxin izolálását és aminosav-össz'etételének megállapítását sertésben (Schwabe, C., McDonald, J.K- és Steinetz, 3.C.: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 75, 503—510 (1977); James, R., Niall, H., Kwak, S. és Briant-Greenwood, G.: Nature, 267, 544—566 (1977)), patkányban (John, M.F., Walsh, J.R., Borjesson, B.W. és Niall, H.D.: Endocrinology 108, 726—729 (1981)) és cápában (Schwabe, C., Gowan, L.K. és Reinig, J.W.: Ann. N.Y. Acad. Sei. 380, 6—12 (1982)). A biológiailag aktív hormon két peptidláncból áll, amelyeket A és B láncként ismerünk, és amelyeket a diszulfid hidak kötnek össze, kettő a láncok között és egy a láncon belül. A szerkezet így rendkívül hasonlít az inzulinra a diszulfid kötések elhelyezkedésében, amely ezeknek a hormonoknak a közös ős-génjére utaló feltételezésekhez vezet (lásd Schwabe ill. James, fentebb idézett irodalmi helyek). A rekombináns DNS technikát alkalmaztuk a cDNS kiónok izolálására mind a pat- 2 1 kány, mind a sertés relaxinhoz (Hudson, P., Haley, J. Cronk, M., Shine, J. és Niall, H.: Nature, 291, 127—131 (1981); 11834/83 (PF 2696/82) ausztrál szabadalmi közrebocsátási irat). Szintetikus undekamer (11 tagú) nukleotidokat- amelyeket a rendelkezésre álló aminosav szekvenciák alapján készítettünk — alkalmaztuk primer mintaként a relaxin cDNS szekvenciákban erősen feldúsított cDNS minták szintéziséhez, amelyek azonosnak tekinthetők azokkal a relaxin cDNS kiónokkal, amelyek a petefészekszövetből származó gén „könyvtáriban találhatók. A relaxin strukturgénről úgy találtuk, hogy mindkét esetben egy egyedi láncból álló prekurzort kódol, amely hasonlít a preproinzulinra általános konfigurációjában, azaz szignél-peptid/B-lánc/C-peptid/A-lánc. 17906/83 számú ausztrál szabadalmi bejelentésünkben, amely megfelel a T/32152 számon közzétett magyar szabadalmi bejelentésnek, leírtuk a sertés relaxin C peptid területen alapuló vizsgálati minták alkalmazását a relaxin gén kiválasztása érdekében a humán genom „könyvtár"-ából. Ez a megközelítés egy genom klón sikeres azonosítását eredményezte, amelyet „Hl"-nek jelöltünk, amelyből a humán preprorelaxin teljes kódoló területének szerkezetét meghatároztuk. A jelen találmány a 17906/83 számú ausztrál szabadalmi bejelentésben leírt munka folytatásának tekinthető, amely munkában arra törekedtünk, hogy bebizonyítsuk a bejelentésben leírt szerkezetet. Megvizsgáltuk a terhes nők petefészek szövetéből származó „könyvtáriban levő cDNS kiónokat, vizsgálati mintaként a C peptid/A lánc kódoló terület (64.— 161. aminosavak) mintegy 300 nukleotidjának megfelelő, korábban azonosított humán Hl gén egy szegmensét alkalmazva vizsgálati mintaként. Pozitív cDNS kiónokat izoláltunk, és ezek szekvencia-vizsgálata egy olyan cDNS szekvenciát tárt fel, amely nem volt azonos a korábban megállapított szekvenciával, és amely a preprorelaxinnak egy olyan formáját kódolja, amely különbözik attól, amelyet korábbi bejelentésünkben leírtunk. A humán genom „könyvtáriból, amelyet az ezzel összefüggő 17906/83 (PF 5352/82) ausztrál szabadalmi bejelentésben leírtunk, egy H2 gén 1. exonját tartalmazó rekombináns fágot is izoláltunk, az 1. exon egy szignálnak, a B pepiidnek és a C peptid egy részének kódoló területét tartalmazza, amely hasonló a Hl gén megfelelő területéhez. Ügy véljük, hogy az itt leírt gének egyike vagy mindkettő, amelyeket „Hl" és „H2” gén jelzéssel láttunk el, és amelyeket 17906/83 számú szabadalmi bejelentésünkben leírtunk, fejeződik ki a humán reproduktív szövetekben, pl. a petefészekben vagy a méhlepényben és/vagy más szövetekben, beleértve (de nem korlátozva ezekre) a beleket, agyat, bőrt, mivel mindkét gén kifejez relaxin-szerű hatást mutató peptideket. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
