197596. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197596 lé (micélium és felülúszó rész együtt)szerves oldószerrel végzett extrahálása után az extraktum 492 nm-nél mért abszorpciós intenzitása, vagy az extraktum kieselgél lemezeken végzett kromatografálása, vagy a Staphylococcus aureus 209 P teszttörzzsel szemben mutatott baktérium elleni hatása alapján ellenőrizhetjük. Szerves oldószerként kloroformot, etil-acetátot, butil-acetátot, butanolt, toluolt vagy benzolt alkalmazhatunk. Az etil - -acetátot előnyben részesítjük. A kezarirodint bármely alkalmas módszerrel különíthetjük el a tenyészléből. Az egyik ilyen módszer (lásd I. szemléltető tábla) extraháláson alapszik. A szűrlet pH értékét 7,5 és 8 közötti értékre állítjuk, majd vízzel nem elegyedő oldószerrel, így etil-acetáttal extraháljuk a kezarirodint. A micéliumban lévő antibiotikum kinyerésére a szűrt vagy centrifugált micéliumot etil-acetáttal, kloroformmal, metanollal, etanollal, acetonnal, butanoilal, metil-etil-ketonnal, sósav-oldattal vagy ecetsav-oldattal kezeljük. Előnyös az aceton alkalmazása. Extrahálás után az oldószert elválasztjuk, a vizes fázis pH-értékét 7,5 és 8 közötti értékre állítjuk, és a vizes fázist éti 1- -acetáttal extraháljuk. A fent megadott extrahálást a micélium elválasztása nélkül is végezhetjük. A szűrletből nyert extraktumot és a micéliumból nyert extraktumot külön-külön vagy együttesen feldolgozzuk, betöményítjük, majd a II. szemléltető táblában bemutatott módon tisztítjuk. Az antibiotikum kinyerésének egy másik módszere adszorpción alapszik. A kezarirodint tartalmazó folyadékot, tehát a szűrt tenyészlét vágy a fenti módon nyert extraktumot oszlopkromatográfiának, folyadékkromatográfiának vagy egyéb olyan módszernek vetjük alá, amelynek során alkalmas adszorbens, így aktívszén, diaion HP-20R, XAD , alumínium-oxid, Kieselgel vagy Sephadex LH-20 adszorbeálja az antibiotikumot. A kezarirodint metanollal vagy acetonnal extraháljuk az adszorbensekről. Az eluátumot szárazra koncentráljuk; a nyers kezarirodin narancsszínű por alakjában képződik. A nyers kezarirodint úgy tisztíthatjuk, hogy a fent leírt extrahálás és adszorbeálás technikáját tetszőlegesen megismételjük. Az adszorbeálást kívánság szerint oszlopkromatográfiásan a már említett adszorbensekkel, vagy ellenáramú megosztásként, vagy vékonyrétegkromatográfiaként végezzük, utána kristályosítunk. További tisztítás nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával érhető el. Ahogy a 11. szemléltető tábla mutatja, a K-frakció három komponenst ad, amelyek közül a félig tiszta A-frakciót tovább tisztítjuk, a tiszta A-kezarirodin kinyerése érdekében. A B-frakcióból hasonlóképpen a tiszta B-kezarirodint nyerjük. A két vegyület szerkezete az (I) általános képletnek felel meg. Az „X" frakció további antraciklintípusú vegyületek keveréke, amelyet még vizsgálunk. 3 A S. purpurascens DSM 2658 törzs tenyészlevéből elkülönített és az I., valamint II. szemléltető tábla szerint tisztított A-, illetve B-kezarirodin szerkezeti képletét a csatolt rajzon tüntettük fel. A találmány szerint előállított kezarirodin antibiotikumok Gram-pozítiv baktériumokkal szemben baktériumölő hatással, továbbá fungicid és antitumor hatással rendelkeznek. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. 1. példa DSM 2658 sz. S purpurascens tenyésztése az antibiotikum hatású komplex fermentálással történő termelése céljából Inokulum készítése A termelő törzset élesztő-maláta- agaron tartjuk, amely összetétele az alábbi: 4 malátakívonat 10,0 g élesztőkívonat 4,0 g glükóz 4,0 g agar 15,0 g desztillált víz I liter pH 7. A tápközeget kémcsövekbe töltjük és 20 percen át 121°C-on sterilizáljuk. A kémcsöveket ferdén helyezzük el, hogy lehűlés közben ferdeagarként dermedjen meg a táptalaj. A ferdeagaros kémcsöveket beoltjuk, 10—15 napon át 28°C-on inkubáljuk. Ha jó növekedést és spóraképződést észlelünk, a spórákból desztillált vízzel szuszpenziót készítünk és az egy kémcsőről levett mennyiséggel egy 500 mles Erlenmeyer lombikot inkubálunk. összesen 5 lombikot készítünk elő, mindegyikben 100 ml alábbi összetételű táptalaj van (használhatunk 5 literes palackot is, 1 liter tápközeggel). Oltótenyészet tápközege glükóz 15,0 g szó ja liszt - 15,0 g kukoricalekvár 5,0 g CaC03 2,0 g NaCl 5,0 g desztillált víz 1 liter pH 7,0 A fenti összetételű tápközegből 100— 100 ml-t 500 ml-es Erlenmeyer lombikba, vagy 1 litert 5 literes szívópalackba töltünk. A tápközeget 20 percen át 121°C-on sterilizáljuk. A lombikokat lehűtjük, a spóraszuszpenzióval beoltjuk, majd forgó rázógépen (frekvencia: 240 perc-1, amplitúdó: 3,75 cm) 28°C-on 72 órán át rázzuk. A jól kinőtt oltókultúrával 15 literes üvegfermentort oltunk be. Az üvegfermentor 10 liter tápközeget tartalmaz, amely nek összetétele az alábbi: Termelő tenyészet tápközegének összetétele glükóz 20,0 g malátakívonat 10,0 g élesztőkívonat 4,0 g 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
