197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására

197595

1978. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 77—90] BamHI hasítási helyére a BamHI enzimmel hasított Xrifd18 DNS 7,5 kb fragmentumát építettük. A plazmidban a bakteriális eredetű rész a teljes rrnB operont tartalmazza, valamint ehhez egy kb. 400 bp hosszú lambda eredetű rész kapcsolódik. Az rrnB operon szabályozó régiójában a 16S rRNS géntől upstream 180 és 300 nukleotidra két promoter található (P, és P2) [Csordás, Tóth és mtsai. 1979, Nucl. Acids. Res. 7, 1335—1342],

2. Az rrnB operont, illetve annak promoter régióját tartalmazó plazmidokon az erős riboszómális promoterektől eredően rendkívül intenzív transzkripció iniciáció van jelen, ami fokozottan igénybe veszi a plazmidot tartalmazó sejt enzimkészletét, és instabilitást okozhat. Ennek elkerülésére a pBB9 plazmidból ín vitro képzett deléciókkal eltávolítottuk a továbbiak szempontjából nem lényeges részeket. Ehhez a pBB9 DNS-t Hpal restrikciós endonukleázzal hasítottuk és a lineáris molekulát különböző ideig BAL31 exonukleázzal kezeltük. Az enzim a molekula végeiről indulva fokozatosan rövidíti a DNS-t mindkét polinukleotid láncon. A BAL31 exonukleázzal különböző mértékben rövidített lineáris plazmidokat tartalmazó DNS mintát a tompa végek összekapcsolására és a molekulák cirkularizálására egyaránt kedvező reakciókörülményeket választva, T4 polinukleotid ligázzal ligáltuk és E.coli HB101 sejtekbe transzformáltuk. A plazmidot tartalmazó sejtekből egyedi kiónokat növesztettünk fel, és azokból izoláltuk a plazmid DNS-t. Restrikciós endonukleázokkal hasítva gélelektroforézissel meghatároztuk a deléciók kiterjedését a minket érdeklő plazmidok keresésére azzal az igénnyel, hogy az érett rRNS-ekre jellemző 5’ és 3’ vég megőrzésével a lerövidített operonon szintetizálódó RNS-ek az rRNS-ekre jellemző úton kerüljenek lebomlásra. Ennek a feltételnek megfelelő plazmidokat pBB9-val jelöljük, egyikük a pBB9A9 (2. ábra). Nukleotid szekvencia meghatározás alapján 269 nukleotidot tartalmaz az érett 16S rRNS szekvencia elejéről, és a teljes 5S rRNS gént az operon végén. A 16S rRNS eleje és a 23S rRNS gén vége közötti fúziós pont környezetének nukleotid szekvenciáját a 3. ábra tartalmazza.

A következő lépésben a plazmidot tovább alakítottuk azzal a céllal, hogy minél kisebb plazmidban legyen a deléciós operon. A pBB9A9 plazmidot, a pBR eredetű részben egy helyen hasító Sáli endonukleázzal linearizáltuk. (Az rrnB operonban lévő két másik Sáli hasítási helyet az előbbi deléció már eltávolította.) Mivel kb. 800 nukleotid a távolság a Sáli hasítási hely és az rrnB operon vége között, a lineáris molekulát addig emésztettük BAL31 nukleázzal, hogy kb. 1600 nukleotiddal rövidüljön meg. Azzal a céllal, hogy a deléciót az rRNS operonnal ellentétes irány- 4

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6

ba megnyújtsuk és nem esszenciális vektvrrészeket is eltávolitsunk, a DNS-t cirkulafizálás előtt PvuII enzimmel is emésztettük. A PvuII tompa véget hoz létre, ami további kezelés nélkül a BAL31 nukleázzal képzett végekhez kapcsolható. Az előbbihez hasonlóan végeztük a DNS ligálását, a transzformációt és egyedi kiónok fizikai térképezését a további munkánkhoz legjobban megfelelő plazmid kiválasztására. A pBB9b28 jelzésű (4. ábra) plazmidban a SafI-BAL31- -PvuII enzimekkel képzett deléció 2174 bp. Az érett 5S szekvencia mögött 510 nukleotiddal kezdődik és a PBR322 plazmid PvuII hasítási helyénél — a vektoron alkalmazott számozás szerint 2067 — végződik. A bakteriális és pBR322 eredetű részek csatlakozási pontjának nukleotid szekvenciáját a 3. ábra tartalmazza.

A harmadik deléciót az rRNS operon promoter régiója előtti rész eltávolítására hoztuk létre. A pBB9b28 plazmidot a 16S rRNS gén előtt egy-egy helyen hasító EcoRI és FspII endonukleázokkal emésztettük és izoláltuk a vektort és az rrnB operon nagyobb részét tartalmazó fragmentumot. Az EcoRI és FspII hasítására képződött fragmentumok végeinek egyesszálú részeit az Eicoli DNS polimeráz I Klenow szubfragmentumának segítségével tompa végekre egészítettük ki, majd T4 indukált polinukleotid ligázzal öszszekapcsoltuk. A helyesen feltöltött végek összekapcsolásával a cirkularizált molekulában helyreáll az EcoRI és FspII enzimek által felismert 6—6 nukleotidból álló szekvencia részlet:(.cj^aGCTD )> tehát a transzformáció után izolált plazmid (p408-5, MNG 00301) mindkét enzimmel línearizálható (5. ábra).

A p408-5 plazmid DNS-t linearizáltuk a P, promoter Pribnow-box előtt 100 nukleotiddal hasító FspII endonukleázzal, és enyhe BAL31 nukleáz kezeléssel a P2 promoter felé haladó deléciósorozatot képeztünk (5. ábra). A ligálás és transzformáció után izolált plazmid DNS-ekben a BspRI, MsrI és Hhal restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek térképezésével és nukleotid szekvencia meghatározással azonosítottuk a deléció végpontjait. A p419—-10 plazmidban pedig a deléció (197 bp) eltávolította a P, promoted és a P2 előtt 100 nukleotiddal van a vége. A vektorból az ampicillin gén előtt 110 nukleotidot távolított el a deléció. A pBR322 és rrnB eredetű rész csatlakozási pontjának környezetében a nukleotid szekvenciát a 3. ábra tartalmazza.

3. A p419—10 plazmidot a P2 promoter és T, terminátor között, a Stul restrikciós endonukleázzal hasítottuk, és a lineáris plaz: mid molekulák tompa végeihez EcoRI linkért kapcsoltunk. A linker-plazmid DNS ligáit elegyét EcoRI enzimmel emésztettük, és a plazmid molekulák cirkularizációját elősegítő -eakciókörülményeket használva, újra ligái-