197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
16 197358 17 4. táblázat: hTNF hatása négy humán tumor sejtvonalra (a hTNF-hez a 0. napon 5xl04 sejtet mérünk) Sejtvonal hTNF mennyisége 3. nap 5. nap 7. nap pg pro-TNF-élő sejtélő sejtélő sejttein/ te-egység sejt szám sejt szám sejt szám nyészet (%) xlO5 (%) xlO5 (%) xl0s BT-20 48.0 1263 24 1.03 16 1.55 5 1.45 (emlő) 19.2 505 30 1.08 19 1.43 7 1.38 (cito-9.6 253 45 1.05 21 1.53 10 1.30 toxikus) 4.8 126 49 1.03 30 1.60 18 1.23 1.2 32 50 1.05 53 1.80 61 2.43 Kontroll 0 93 0.99 94 2.23 96 3.39 ME-180 24.5 645 83 1.78 52 2.70 49 6.33 (nyak) 9.8 258 83 1.73 57 2.83 49 7.38 (cito-4.9 129 80 1.75 70 3.48 58 8.03 toxikus) 2.45 63 81 1.73 76 4.00 63 8.23 Kontroll 0 98 1.62 97 4.48 97 1.01 SK-MEL-109 24.5 645 91 0.80 86 1.63 72 1.68 (melanoma) 9.8 258 96 1.15 90 1.93 91 2.68 (citoszta-4.9 129 94 1.35 93 2.13 90 2.93 tikus) 2.45 63 94 1.25 93 2.10 92 3.13 Kontroll 0 98 2.19 98 3.89 99 9.78 T-24 48.0 1263 95 2.38 98 4.60 99 7.75 (hólyag) 19.2 505 96 2.83 97 4.55 98 8.58 (hatástalan) 9.6 253 97 2.78 98 4.65 98 8.33 4.8 126 98 3.25 99 4.55 98 8.33 Kontroll . 0 100 3.23 98 4.53 99 8.38 tűnik, hogy a hTNF csak tumoros humán sejteken fejti ki citotoxikus, citosztatikus vagy vérzéses nekrózist okozó hatását. A hTNF humán célsejtekkel szembeni specifikus akti- 40 vitása nagyobb, mint az egér TNF-é. A hTNF különféle humán sejtvonalakra kifejtett hatását az alábbi eljárás szerint határozhatjuk meg. A sejteket tripszinezzük, kétszer öblítjük, és 45 8% FCS-t tartalmazó táptalajban 4-5xl04 sejt/lyuk koncentrációban 24 lyukú Costar lemezre visszük, majd 37 °C-on inkubáljuk. 16-24 órán át tartó inkubálás után a táptalajt leszivatjuk, és a sejtekhez 1 ml-es higi- 50 tásban DEAE-frakcionált hTNF-et mérünk. Az összes sejtszámot - azaz az élő és elpusztult sejtek számát - a 3., 5. és 7. napon fázis-mikroszkópos eljárással határozzuk meg. A tenyészeteket az 5. napon a hTNF-et azo- 55 nos koncentrációban tartalmazó friss táptalajjal töltjük fel. A fenti eljárással kaptuk a 3-4. táblázatban ismertetett eredményeket. A fentiek értelmében a hTNF humán tumorok és rákos rendellenességek kezelésére 60 használható. Maximális gyógyhatás elérésére a rákos betegeket nyilvánvalóan vagy a TNF termelésre kell serkenteni, vagy a fenti anyaggal kell kezelni, vagy a teljesebb hatás elérése céljából a két módszert váltogatni 65 10 1 ell, illetve különböző, meghatározott sorrendet kell betartani. A hTNF mint az immunrendszer biológiai válaszát módosító anyag működik. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás közelítőleg 70 000 g/mól relatív móltömegű, pH 6 és pH 8 közötti tartományban stabil, egér L-sejtekkel végzett in \ itro meghatározás szerint 2-5xl04 egység//mg protein specifikus aktivitású, -78 °C és -20 °C közötti hőmérséklettartományban stabil, 56 °C-on 60 percen át stabil, tisztított I TNF-elöállitására, azzal jellemezve, hogy ( ) humán B-sejteket szövettenyésztó tápközegben inkubálunk, ( i) a humán B-sejt-tenyészet felülúszóját elválasztjuk a humán B-sejtektől, ( ii) a felülúszót frakcionáljuk, ( v ) a hTNF-et tartalmazó frakciókat azonosítjuk és összegyűjtjük, és kívánt esetben (v) koncentráljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben az inkubálást 0-8% magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban végezzük.
