197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
12 197358 13 2. táblázat: RPMI 1640 folyékony táptalaj összetétele (IX) összetevők Koncentráció (mg/1) Szervetlen sók Ca(N03)2.4H20 100.00 KC1 400.00 MgS04.7H20 100.00 NaCl 6000.00 NaHC03 2000.00 Na2HP04.7H20 1512.00 Egyéb komponensek D-glükóz 2000.00 glutation (redukált) 1.00 Aminosavak L-arginin (szabad bázis) 200.00 L-aszparagin 50.00 L-aszparaginsav 20.00 L-cisztin 50.00 L-glutaminsav 20.00 L-glutamin 300.00 glicin 10.00 L-hisztidin (szabad bázis) 15.00 L-hidroxi-prolin 20.00 L-izoleucin (allo-mentes) 50.00 L-leucin (metionin-mentes) 50.00 L-lizin.HCl 40.00 L-metionin 15.00 L-fenilalanin 15.00 L-prolin (L-hidroxi-prolin-mentes) 20.00 L-szerin 30.00 L-treonin (allo-mentes) 20.00 L-triptofán 5.00 L-tirozin 20.00 L-valin 20.00 Vitaminok biotin 0.20 D-kalcium-pantotenát 0.25 kolin-klorid 3.00 folsav 1.00 i-inozitol 35.00 nikotinamid 1.00 p-amino-benzoesav 1.00 piridoxin.HCl 1.00 riboflavin 0.20 tiamin-HCl 1.00 Bi2-vitamin 0.005 A találmányt közelebbről az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. 2. példa hTNF előállítása és koncentrálása LuklI sejtekből 5% FCS-t és 10 ng/ml PMA-t tartalmazó RPMI 1640 táptalajban ml-enként 5xl05 LuklI sejtet szuszpendálunk, és a tenyészetet 8 37 °C-on 48 órán át inkubáljuk. Ezután a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és 8-iOxlO5 sejt/ml koncentrációban szérum-mentes, 2 nmól/1 etanol-amint tartalmazó R-ITS PREMIX-ben [5 Mg/ml inzulin, 5 Mg/ml transzferrin, 5 ng/ml szelén szérum-pótló (Collaborative Research, Waltham Mass)] újrasz iszpendáljuk és további 48 órán át inkubáljuk. A felülúszókat centrifugálással sejtmentesitjük, és -20 °C-on megfagyasztjuk. Az LuklI sejtek felülúszóját PM10 membránnal ellátott kevert Amicon cellában koncentráljuk, majd 40x2,6 cm-es, 0,15 mól/1 nátriun -kloridot tartalmazó 0,05 mól/l-es Tris-pnfferoldattal (pH 7,3) ekvilibrált DEAE-Sephadex ■ A-50 töltetű oszlopra visszük, 5 "C-on. A fenti összetételű pufferoldattal 5 nl-es frakciókat eluálunk. A kezdeti átfolyó frakciókban meghatározzuk a TNF-aktivitást, majd a csúcs-frakciókat összegyűjtjük. A fenti eljárással a specifikus aktivitást 25- -szörösére növeljük (2-5xl04 egység/mg protein). Az in vitro L-sejt vizsgálattal meghatározott hTNF-aktiv frakciókat összegyűjtjük és Amicon cellában koncentráljuk. Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus aktivitása közelítőleg lxlO3 és lxLO4 közötti tartományba esik abban az esetben, ha a sejteket magzati borjúszérummal (FCS) kiegészített táptalajban tenyésztettük. Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus aktivitása közelítőleg 2xl04 és 5xl04 Mg közötti tartományban van abban az esetben, ha a sejteket szérum-mentes táptalajban tenyésztettük. A DEAE-oszlopon frakcionált hTNF intravénásán injektálva a fentebb ismei-tetett in vfro vizsgálatban Meth A tumorokon vérzéses nekrózist okozott. 300 Mg hTNF 5 egér közül 1-öen +++ erősségű nekrózist váltott ki, míg a fennmaradó 4 állat esetén a nekrózis ++ erősségű volt. 150 Mg hTNF 7 egér közül 5 állatban ++ erősségű, 2 állatban + erősségű nekrózist okozott. 75 Mg hTNF 5 állat közül 1 állatban ++ erősségű, 4 állatban + erősségű nekrózist okozott. A kontroll csoportban 3 állat közül egynél sem találtunk nekrózist, a kontroll állatoknak azonos mennyiségű, DEAE-oszlopon frakcionált RPMI 1640 táptalajt injektáltunk. A fentiek értelmében a hTNF mind az in vitro, mind az in vivo TNF meghatározásra szolgáló vizsgálatban aktívnak bizonyult. A hTNF molekulatömege - akár FCS-t tartalmazó, akár FCS nélküli táptalajon nyertül; - közelítőleg 70 000 dalton, Sephacryl S-200 oszlopon végzett meghatározás szerint. 12 órát meghaladó savas vagy lúgos kezelés hutására a hTNF aktivitása csökken, például pH 2,0-nél az aktivitás 90%-a, pH 4,0-nél 55%-a, pH 10-nél közel 45%-a megsemmisül. Hő stabilitását tekintve a hTNF aktivitása 70 °C-on 60 perces kezelés hatására megsemmisül, mig 56 °C-on 60 perces kezelés után megmarad. Az aktivitás még huzamos ideig 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
