197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
17 197357 18 C. A fénytöréssel rendelkező testek kinyerése Amint az 1. folyamatábrán látható, tekintettel arra, hogy a fénytöréssel rendelkező testek a sejteken belül helyezkednek el, kívánatos, hogy először megbontsuk a sejteket. Ezáltal kiszabadítjuk a fénytöréssel rendelkező testeket és hozzáférhetővé tesszük őket a kinyerés számára, amely például centrifugálással történhet. A találmány szerinti eljárás egyik változata szerint a fénytöréssel rendelkező fehérjéket egyszerűen oly módon tisztítjuk, hogy gondoskodunk a sejt olyan mértékű megbontásáról, hogy sejttörmelék ne legyen a kis sebességű centrifugálással elkülönített szemcsékben. A találmány szerinti eljárás e változatánál a sejteket 5-9 közötti, előnyösen 6-8 közötti pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk, 0,01-2 M, előnyösen 0,1-0,2 M ionerösség alkalmazásával. Bármilyen alkalmas só, így a nátrium-klorid is felhasználható a megfelelő ionerösség fenntartására. Ez az ionerősség-tartomány ismereteink szerint megfelelő a találmány szerinti eljáráshoz, jóllehet nem ismerjük pontosan a megengedhető ionerősség pontos szélső értékeit. Nem kívánatos azonban, hogy lényegében zérus ionerősséget alkalmazunk. A fenti pufferoldatban szuszpendált sejteket ezután a szokásos módszerekkel elbontjuk, például mechanikai módszerekkel, mint Manton-Gaulin-prés, francia prés vagy ultrahang oszcillátor használatával, vagy vegyi vagy enzimes módszerekkel, például lizozimmal végzett kezeléssel. Amikor úgy ítéljük meg, hogy a sejtek megbontása kielégítő mértékű, és alig marad vissza vagy egyáltalán nem marad vissza centrifugálható méretű sejttöredék, a szuszpenziót kis sebességgel, a gravitáció 500- -5000-szeresének, előnyösen körülbelül 1000- -szeresének megfelelő érték mellett centrifugáljuk hagyományos centrifugában, a térfogattól függően megfelelő ideig, rendszerint 10-30 percig. A centrifugálással kapott üledék a fénytöréssel rendelkező fehérjék gyakorlatilag teljes mennyiségét tartalmazza. Abban az esetben azonban, ha a sejtek megbontása nem volt teljes, az üledékben sejttöredékek is lehetnek. Azt, hogy a sejtek megbontása tökéletes-e, úgy ellenőrizhetjük, hogy az üledéket ugyanolyan pufferoldat kis mennyiségében szuszpendáljuk, és fáziskontraszt mikroszkóp segítségével megvizsgáljuk. Sejttörmelékek jelenlétéből az következik, hogy további ultrahangos kezelésre vagy más megbontási módszer alkalmazására van szükség annak érdekében, hogy eltávolitsuk ezeket. Miután az esetleges további megbontás megtörtént, a szuszpenziót ismét centrifugáljuk, az üledéket elkülönítjük, a pufferoldatban újból szuszpendáljuk és újból megvizsgáljuk. Ezt az eljárást addig folytatjuk, amíg a vizuális vizsgálat azt nem mutatja, hogy fénytöréssel nem rendelkező fehérjék már nincsenek jelen az üledékben. Az egyes fehérjék esetén jól meghatározhatjuk az alkalmazandó körülményeket, úgy, hogy a találmány szerinti eljárás kivitelezésénél mindössze egyetlen szuszpendálásra, megbontásra és centrifugálásra legyen szükség. Még ilyen esetben is előnyös, ha a találmány szerinti eljárást a fentiek szerint több lépés, különösen előnyösen összesen három lépés alkalmazásával vitelezzük ki, mivel ezáltal előnyösen csökkenthetjük a vizes pufferoldatból szükséges mennyiségeket (azaz a szemcse ismételt szuszpendálásához lényegesen kisebb menynyiség szükséges a pufferoldatból, mint az eredeti sejtszuszpenzióhoz). A termék minőségét vizuális ellenőrzéssel megfelelően biztosíthatjuk. Az ilyen módon előállított üledékben jelenlevő fehérjéknek általában 40-90%-át képezi a kívánt heterológ fehérje, attól függően, hogy a gazdasejt milyen fehérjét termelt. Például emberi növekedési hormon esetén - amikor azt az 1-8. példában részletezett műveletekkel állítottuk elő - a fénytöréssel rendelkező fehérjének több mint 90%-a valóban a kívánt fehérje volt (a példákban ismertetett módszerekkel végzett mérés szerint). Humán interferonok és a vírus antigén fehérjék esetén azonban csak körülbelül 50% volt a kívánt fehérje mennyisége. A fenti szélső értékek közötti mennyiségeket kaptuk plazminogén aktivátor és borjú kimozin esetén. Ezek a tisztaságok elegendők a kivánt fehérje néhány felhasználásához. Az üledék feloldható a denaturálószer oldatában, és az így nyert oldat a fehérjét vagy aktív vagy pedig inaktív alakban tartalmazza. A fentebb említett 1-8. példákban ismertetjük azokat az eredményeket, amelyeket akkor kaptunk, amikor egyedül ezt a módszert alkalmaztuk a fénytöréssel rendelkező fehérjék elkülönítésére. Ez a módszer a legelőnyösebben baktériumtenyészetben, különösen előnyösen Escherichia coli tenyészetben termelt heterológ fehérjékre és a következő fehérjék elkülönítésére alkalmazható: emberi növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, sertés növekedési hormon, humán fibroblaszt interferon, humán immun interferon (IIF), az emberi szövetekben lévő plazminogén aktivátor (tPA), borjú prokimozin (prorennin) és a száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérjék. A későbbiekben ismertetjük a találmány szerinti eljárásnak azt a változatát, amelytől a fenti esetekben kölcsönöztük az üledékké alakított fehérje denaturálószerben történő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
