197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
51 197357 52 raecetsavat tartalmazott, és 7,5 pH-értékû volt. A szuszpendált sejteket megbontottuk Manton Gaulin prés segítségével, 41 370 kPa nyomáson. A szuszpenziót négyszer vezettük át a présen, majd 30 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 4000-szeresének megfelelő érték mellett. A felülúszó folyadékot elöntöttük, az üledéket 2 liter mennyiségű, ugyanilyen pufferoldatban szuszpendáltuk, és ismét 30 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 4000-szeresénél. A felülúszó folyadékot ismét elöntöttük, az üledéket pedig 6 M guanidin-hidroklorid-oldatban oldottuk, amely oldat 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, és a pH-értéke 8 volt. A szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjét ezután szulfonáltuk oly módon, hogy egy frissen készített és derített, nátrium-szulfitot és nátrium-tetrationátot tartalmazó törzsoldat hozzáadásával 20 mg/ml nátrium-szulfit-koncentrációt és 10 mg/ml nátrium-tetrationát-koncentrációt állítottunk be. Hagytuk, hogy a szulfonálás 4 óra alatt végbemenjen szobahőmérsékleten. Az oldatot ezután dializáltuk 5 órán át 5 M karbamid-oldattal szemben, amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, és a pH-értéke 7,5 volt. A dialízissel kapott oldatot 10 cmx35 cm méretű DE-52 oszlopra vittük fel, ahol az oszlopot előzetesen ugyanezzel a .megkötő" pufferoldattal (5 M karbamid, 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-raetán-hidroklorid, pH=7,5) mostuk. Az oldatot 750 ml/óra sebességgel adtuk az oszlopra, és egy éjszakán át mostuk az oszlopot a fenti pufferoldattal. A DE-52 oszlopot ezután eluáltuk 0-ról 0,15 M-ra növelt nátrium-klorid-grádiens mellett, 1 liter/óra áramlási sebességgel, 16 órán át. A fehérje fő tömege 0,070 M nátriura-klorid-koncentráció közelében oldódott le az oszlopról. A prorennint tartalmazó frakciókat ismert dializáló szűrésnek vetettük alá 5 M karbamidot és 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot tartalmazó, pH=8,5 értékű oldattal szemben, és a kapott oldat redukált glutation-koncentrációját (GSH) 1 mM-ra, oxidált glutation-koncentrációját (GSSG) 0,1 mM-ra állítottuk be, és egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A karbamidot egy újabb dializáló szűréssel távolítottuk el 0,1 mM redukált glutationt tartalmazó, pH=8,0 értékű 50 mM triszíhidroxi-metil)-amino-metán-oldat alkalmazásával. A kapott oldat mentes volt a denaturálószertől, és 5,5 g fehérjét tartalmazott. Az össztermelés mintegy IX volt. A fehérje biológiai aktivitását a prorennin antis zérumraal adott reakciója mutatta, valamint az, hogy autokatalitikus aktiválás után aktiv volt a standard tejalvadást kiváltó vizsgálatnál. Aktív urokináz előállítása vészleges szulfitolizissel A 368 773 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben és az annak megfelelő 92 182 sz. európai szabadalmi leírásban leirt (a bejelentés napja 1982. április 15.) Escherichia coli K-12 W3110/pUK 33trpLEi törzs tenyészetétől az 1. példában ismertetett módon elkülönítettük az urokinázt tartalmazó, fénytöréssel rendelkező testeket. Ez utóbbiakat 5 M guanidin-hidroklorid-oldat.ban oldottuk, amely 50 mM triszfhidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, s a pH-értéke 8,0 volt. 0,2 mg/ml nátrium-szulfit-koncentrációt és 0,1 mg/ml nátrium-tetrationát-koncentrációt állítottunk be az oldatban, és egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az oldatot ezután 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán pufferoldattal (pH=9,0) addig hígítottuk, amíg a guanidin-hidroklorid koncentrációja 1,5 M nem lett, majd 10 mM redukált glutation-koncentrációt (GSH) és 1 mM oxidált glutation-koncentrációt (GSSG) állítottunk be. Az oldott fehérjét tartalmazó híg guanidin-oldatot ismét egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten, és vizes oldatba dializáltuk. Amig a fénytöréssel rendelkező testek aktivitása a standard urokináz biológiai vizsgálatnál 0,25 PU/mg volt, addig a fenti módon elkülönített urokináz aktivitása 150 PU//mg értéknek adódott. 13. példa 14. példa Az urokináz újraaktiválása redox pufferrel A 13. példában ismertetett, fénytöréssel rendelkező testeket olyan 5 M guanidin-hidroklorid-oldatban oldottuk, amely 50 mM trísz(hidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, s a pH-értéke 8,0 volt, majd a kapott oldatot dializáltuk 2 M karbamidot és 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot tartalmazó, pH=7 értékű oldattal szemben. Az oldatban ezután 10 mM redukált glutation-koncentrációt (GSH) és 1 mM oxidált glutation-koncentrációt (GSSG) állítottunk be, és az oldatot egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A kívánt konformációjú fehérjét tartalmazó oldatot dializáltuk vizes közeg alkalmazásával. A kapott oldat urokinázt tartalmazott, amelynek az aktivitása 30 PU/mg volt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 27
