197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
37 197357 38 amig az ismételten szuszpendált üledék vizuális vizsgálata csak fénytöréssel rendelkező részecskéket mutatott. A 2. ábrán az 1. ábrán bemutatott sejtekből az 1. példában ismertetett módon nyert, újraszuszpendált üledék fáziskontraszt mikroszkóp alatti képe látható. A 2. ábrából kitűnik, hogy a szuszpenzió főleg fénytöréssel rendelkező testekből áll, kevés sejttel és sejttörmelékkel együtt. Abban az esetben, ha a szuszpenzióban sejtek vagy sejttörmelékek is jelen voltak, azokat újból megbontottuk. A fénytöréssel rendelkező testeket általában 3-4 fentebb ismertetett ciklus után különítettük el. A fénytöréssel rendelkező testek ezután megfagyasztva tárolhatók, üledékként vagy szuszpenzióban, és a fehérjetartalmuk 95%. A fénytöréssel rendelkező testekből álló készítmény azonosítását nátrium-dodecíl-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel, .Western biot" módszerrel és/vagy radioaktív immunológiai vizsgálattal (RIA) végeztük. A 3. ábrán a sertés növekedési hormonnal (pGH), veszettség elleni antigénnel és urokinázzal (UK) végzett tisztítás eredményeit mutatjuk be. (Az ábrán a sertés növekedési hormont, veszettség elleni antigén illetve urokinázt termelő sejttenyészetek ultrahanggal kezelt egész sejtjeinek (2., 4. és 6. oszlop) valamint az 1. példa szerint előállított, ultrahanggal kezelt szemcséinek nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézise látható. A szemcsék vizsgálatára a 3., 5. illetve 7, oszlop vonatkozik. Az egész sejtek keverékként jelennek meg. A veszettség elleni antigént és a sertés növekedési hormont tartalmazó szemcsék egyetlen sávot eredményeznek. Az urokinázra kapott sávrendszer bonyolultabb a számos allotrop alakja miatt. A 3. ábra 1. oszlopa a pBR322 plazmíddal transzformált Escherichia coli K-12 W3110 törzs ultrahanggal kezelt sejtjeinek felel meg. 2. példa Emberi növekedési hormon -Az emberi növekedési hormon génjént hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pl07 törzset (amelyet a 4 342 832 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet) fermentorban szaporítottuk, majd a sejteket elkülönítettük és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elválasztottuk az 1. példában ismertetett módon. A részecskék 22 000 dalton molekulatömegnek megfelelő fehérjesávot mutattak 2- -merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisnél. A gél denzitométeres vizsgálata azt az eredményt szolgáltatta, hogy ez a fehérje több mint 90%-át képezi a fénytöréssel rendelkező részecskék teljes fehérjetartalmának. A .Western biot" módszerrel azonosítottuk ezt a fehérjét emberi növekedési hormonként. 1 g nedves sejtpépböl mintegy 10- -20 mg mennyiségben nyertük ki a fénytöréssel rendelkező részecskéket. A 4A. ábrán az első centrifugálással kapott üledék szuszpenziójában lévő, fénytöréssel rendelkező, emberi növekedési hormont tartalmazó testek fáziskontraszt mikroszkóp alatti képe látható. A 4B. ábra a fenti, savval elölt és elöletlen sejtek nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisének eredményeit mutatja be. Az 1. és 3. oszlop elölt illetve elöletlen sejteknek (egész sejteknek) felelnek meg. Ezek az oszlopok fehérjekeverékeket és hozzávetőleg azonos mennyiségű emberi növekedési hormont jeleznek. A 2. és 4. oszlop elölt illetve elöletlen sejtekből elkülönített, fénytöréssel rendelkező sejtek extraktumainak felelnek meg. Az elölt sejtek esetén az emberi növekedési hormonra vonatkozó sáv nagyobb. 3. példa Szarvasmarha növekedési hormon (bGH) A szarvasmarha növekedési hormon génjét hordozó rekombinánlt DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pBGH-l törzset (amelyet a 303 687 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és az annak megfelelő 75 444 számú európai szabadalmi leírás és 2 106 219 számú angol szabadalmi leírás ír le, a bejelentés napja 1981. szeptember 18.) fermentorban tenyésztettünk, majd a sejteket összegyűjtöttük, amint azt az 1. példában ismertettük. (A fermentorban lévő sejteket az összegyűjtés előtt 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltük.) A fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük, és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében poliakrilamidgél-elektroforézissel vizsgáltuk. Egyetlen fehérjesávot kaptunk, amely a 22 000 dalton molekulatömegű standard anyagnak felelt meg. A gél denzitométeres vizsgálata azt mutatta, hogy ez a sáv a fénytöréssel rendelkező részecskék teljes fehérjetartalmának több mint 90%-át képezi. Miután a részecskéket 7 M guanidin-oldatban oldottuk, és az oldattal dialízist végeztünk 7 M karbamid-oldatban, a szarvasmarha növekedési hormon jelenlétét radioaktív immunológiai vizsgálattal (RIA) igazoltuk. 1 g nedves sejtpépből körülbelül 20 mg mennyiségű, fénytöréssel rendelkező részecskéket nyertünk ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
