197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
33 197357 34 csapott gazdasejtfehérjét, valamint sejttörmeléket tartalmaz. Néha elegendő az eddig leirt tisztítás ahhoz, hogy a kapott fehérjét felhasználhassuk, mindössze gyengítenünk kell a denaturálószer hatását hígítással vagy puffercserével. Ebben az esetben elhagyható a 3. és 4. lépés, és közvetlenül az 5. lépést vitelezzük ki az alábbiak szerint. A 2. folyamatábrán feltüntetett 5. lépésben a kívánt fehérjét olyan módon nyerjük ki biológiailag aktiv alakban, hogy a denaturálószert alkalmas oldószerközeggel cseréjük fel. Egyes fehérjéknél elegendő, ha az eredetileg jelenlevő denaturálószert kisebb koncentrációra hígítjuk. Más fehérjéknél viszont arra van szükség, hogy puffercserét hajtsunk végre, és egy olyan oldatba vigyük át a fehérjét, amely egy kevésbé kaotrop denaturálószert, például karbamidot tartalmaz. A végső lépést az elkülönítésnél redukálószer távollétében vitelezzük ki, hogy ismét kialakulhassanak a diszulfid-kötések, miután a fehérje kiegyenesedett a gyengébb denaturélószerben. Ha viszont kívánatos további tisztítás, akkor elvégezhetjük a fakultativ lépéseket redukálószer jelenlétében, hogy fokozzuk a tisztaságot az újranaturálás előtt. A tisztítás több módszerrel is történhet. Néhány példaképpel és előnyős módszert az alábbiakban ismertetünk. A 3. lépés során a denaturálószert, redukálószert és a kívánt fehérjét tartalmazó oldatot méret szerinti elkülönítést célzó gélszűréssel kromatografáljuk. Az, hogy milyen pórusméretű gélt választunk ki, függ a tisztítani kívánt fehérje természetétől. A széj- és körömfájás vírus fehérjéihez megfelelő például a Sephacryl -S-300 (gyártó: Pharmacia). A gélszűrést végezhetjük egy olyan ionos denaturálószer nagy koncentrációja jelenlétében, amely felhasználható a kívánt fehérje szolubilizálására. Nyilvánvaló azonban, hogy egy ilyen oldattal nem végezhető el a 4. lépés szerinti ioncserélő kromatográfiás tisztítás. Ezért, ha ioncserén alapuló további tisztításra is szükség van még, a denaturáló oldatot, ha az tartalmaz ionokat, például guanidint, vagy gélpermeációs kromatográfiánál képződő eluátumot, ha az tartalmaz még ionokat, az ionokat eltávolító kezelésnek kell alávetnünk. Ez dialízissel történhet egy olyan, előnyösen lúgos pufferoldattal szemben, amely ismét tartalmaz redukálószert és nagy koncentrációban semleges denaturálószert, például mintegy 8 mól karbamidot, hogy biztosított legyen a heterológ fehérje szolubilizációja. Amikor a sókat eltávolitottuk, a dialízis során visszamaradt anyagot kromatográfiának vetjük alá, megfelelő ioncserélő oszlop, például DEAE cellulóz alkalmazásával. A kromatográfiás kezelés körülményeit előnyösen úgy választjuk meg, hogy a kívánt fehérje átfolyhasson az oszlopon a hézagtérfogatban. Ez előnyös, mivel kevesebb ioncserélő gyantára van szükség, ha a nyomokban jelenlevő szennyező anyagokat kell a gyanta segítségével adszorpcióval eltávolítanunk, mint amikor a fehérjét kötjük meg a gyantán, amely fehérje a tisztítás e szakaszában a kívánt termék. Az oszlopon átfolyó folyadékot, amely a tisztított fehérjét és a (semleges) denaturálószert tartalmazza, vagy ebben a formájában használja fel - erre egyes esetekben lehetőség van -, vagy megszabadítjuk a denaturálószertöl egy higabb oldattal szemben végzett dialízissel. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy egyes esetekben, a fehérje kicsapódásának megakadályozására szükség van egy előzetes puffercserére, amelynél a fehérjét higabb karbamid-oldatba visszük át, majd ezt követően végezzük el a végső puffercserét víz vagy pufferoldat alkalmazásával. A 2. folyamatábrán vázolt valamennyi lépésnél, egészen az utolsóig, redukélószernek jelen kell lennie. Az alkalmas redukálószereket fentebb ismertettük, és kifejtettük azokat az okokat is, amelyekből kifolyólag a használatukra szükség van. A kapott oldatban jelenlevő fehérje rendszerint 95-99%-os tisztaságú. A heterológ fehérje kinyerésénél a termelés általában legalább 50%, és akár 98% is lehet. A fentebb ismertetett találmány szerinti eljárásváltozat különösen előnyösen alkalmazható a kővetkező fehérjékre: emberi növekedési hormon, sertés növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, szarvasmarha interferon, a szövetekben jelenlevő plazminogén aktivátor és száj- és körömfájás virus bevonata. I. Példák A találmányt az alábbi példákkal részletesen ismertetjük az oltalmi kör korlátozása nélkül. Az 1-8. példa a gazdasejtfehérjék szolubilizélását és a fénytöréssel rendelkező testeknek például kissebességű centrifugálással történő kinyerését mutatja be. A 9. példa azt szemlélteti, hogyan növelhetjük a fénytöréssel rendelkező testek mennyiségét a sejtek elölésével. A 10. és 11. példa arra a találmány szerinti többlépéses eljárásra vonatkozik, amelynél az előzetes elbontást és a baktériumfehérjék eltávolítását összekapcsoljuk a fénytöréssel rendelkező fehérjék és - elkerülhetetlenül - bizonyos szennyező anyagok erős denaturálószerrel történő szolubilizélásával, majd kívánt esetben tisztítást végzünk, amely gélszűrésból vagy nagy sebes-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
