197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
12 197356 13 legkülönbözőbb prokarióta expressziós rendszerekbe univerzálisan beépíthető. A pUC12 és pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals, 5401 St. Goar: The Molecular Biology Catalogue 1983, Appendix, 89. oldal) plazmidok egy-egy polilinker szekvenciát tartalmaznak. A pUC13 plazmidba, mégpedig az Xmal és a SacI restrikciós vágóhelyek közé a pK150 plazmidból (7. ábra) származó HindlII-hirudin-SacI-fragmenssel fuzionált, maga a p 106/4 plazmidból (2. ábra) származó Mstl-HindlII-trp-fragmenst építjük. E célból a pUC13 plazmid DNS-ét először az Xmal restrikciós enzimmel kezeljük. A kiegyenesített plazmid végeit Klenow-poliraerázzal feltöltjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt követően a DNS-t vizes közegben a pH 106/4 plazmidból izolált Mstl-HindlII-trp-D-fragmenssel és a pK150 plazmidból izolált HindlII-SacI-hirudin-fragmenssel T4 DNS-ligáz jelenlétében reagáltatjuk. Az így kapott pK160 plazmid közvetlenül a trp-D-szekvencia előtt többfúziós felismerési szakaszt tartalmaz, amely az Xmal, Smal, BamHI, Xbal, Hindi, Sáli, AccI, PstI és Hindui restrikciós enzimek számára felismerhető vágóhelyeket tartalmaz. Emellett a hirudin-szekvencia 3’-végén EcoRI-vágóhely adódik (8. ábra). 11. példa A pH131/5 plazmidot (a nyilvánosságra nem hozott P 3 514 113.1 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés 1. példája szerint) úgy állítjuk elő, hogy a ptrpLl plazmidot [J.C. Edman és mts-i, Nature 291 (1981) 503-306] Clal enzimmel megnyitjuk, majd a szintetikusan előállított, önkomplementer (N9) képletű oligonukleotiddel 5’ pCGACCATGGT 3’ (N9) ligáljuk. Az Így kapott pH131/5 plazmid (9. ábra) már tartalmaz felismerési helyet az Ncol enzim számára. E helyen a plazmidot megnyitjuk, a túlnyúló végeket Klenow-polimeráz reakcióval kiegészítjük, és a kiegyenesített, sima végű DNS-t EcoRI enzimmel utóvágjuk. A két keletkezett DNS-szekvencia közül a nagyobbikat etanolos kicsapással a kisebb szekvenciától elválasztjuk. A pH131/5 plazmid így nyert maradék DNS-ét a pK160 plazmidból származó, trp-D’-hirudint kódoló fragmenssel ligáljuk T4 ligázzal. Az említett fragmenst a pK160 plazmidból vágjuk ki a Hinc II és EcoRI enzimekkel, gél-elektroforetikusan elválasztjuk a maradék plazmidtól, majd a gélanyagból eluáljuk. A ligációs terméket az E. coli K12 törzsbe transzformáljuk. A plazmid-DNS-t tartalmazó kiónokat izoláljuk és restrikciós elemzéssel, valamint DNS-szekvencia-elemzéssel azonosítjuk. A kapott pK-170 plazmid (9. ábra) a trp-operatorhoz fuzionálva olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, 8 amely a Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-trp-D’-(hirudin) sorozatot kódolja. 12. példa A pJF118 plazmidot (6. példa) EcoRI enzimmel megnyitjuk, és a túlnyúló DNS-végeket Klenow-polimeráz-reakcióval sima véggé alakítjuk. Az így kezelt plazmidot a Sáli enzimmel vágjuk. A rövid EcoRI-Sall fragmenst gélelektroforézissel eltávolítjuk. A pK170 plazmidot (11. példa) Ncol enzimmel vágjuk, és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal sima véggé alakítjuk. A plazmid-DNS-t etanolos kicsapással elválasztjuk a reakcióelegyből, majd a HindlII és BamHI enzimekkel kezeljük. A keletkező több fragmens közül kettőt elkülönítünk, mégpedig a (feltöltött végű) NcoI-trpD’-HindlII-fragmenst és a HindlII-hirudin-BamHI-fragmenst (9. ábra) (3 429 430 sz. NSZK-beli kőzrebocsátási irat). A két fragmenst elektroforetikai módon izoláljuk. Végül a 3 429 430 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat 2. ábrája szerinti BamHI-SalI-hirudinll-fragmenst izoláljuk. Mind a négy fragmenst, azaz a pJF118 plazmid maradékát, az NcoI-trpD’-HindlII-fragmenst, a HindlII-hirudin-BamHI-fragmenst és a hirudinll-fragmenst ligációs reakcióban reagáltatjuk egymással. A kapott pK180 plazmidot (10. ábra) a E. coli K12-W 3110 baktériumba transzformáljuk. A tervezettnek megfelelő plazmid-DNS-ben EcoRI-trpD’-hirudin-Sall-fragmens mutatható ki. A trpD’-hirudin-szekvencia most össze van kötve a tac-promotorral. A fúziós protein expressziója a 6. példában leírtak szerint történik. 13. példa A pBR 322 plazmidtól leszármaztatott plazmidok, így a pH120/14 (1. példa, 1. ábra), pH154/25 (1. példa, 3. ábra), pH256 (4. példa, 5. ábra), pK150 (8. példa 7. ábra) és pK170 (11. példa, 9. ábra) plazmidok esetén (az ábrákon az óramutató irányában) a fúziós protein indító kodonja és a legközelebbi Hind-III-hely (a pBR322 29. helyén lévő HindlII-nak a megfelelője) között a trp-promotort és -operátort tartalmazó fragmensben (bár nem a promotor tartományán belül) járulékos PvuII-hely van. Azt tapasztaltuk, hogy ha az említett PvuII-hely és a pBR322 plazmid 2066. helyének megfelelő PvuII-hely közötti DNS-szakaszt eltávolítjuk, a klónozott, illetve a fúziós protein hozama észrevehetően növekszik. Az alábbiakban példaként a pH 154/25 plazmid rövidítését írjuk le pH154/25' plazmiddá. Ez a művelet a többi említett plazmid esetén analóg módon elvégezhető (az így rö-5 !0 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65
