197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
6 197356 7 két Pvu-vágóhellyel ligálhatjuk. A kapott plazmid mintegy 2 kbp-ral (kilobázispárral) kisebb; az expresszió növekedését eredményezi, vélhetően a gazdasejtben készülő kópiák nagyobb száma miatt. 1. példa a) Kromoszómából származó E. coli-DNS-t Hinf I enzimmel vágunk és a 492 bp fragmenst elkülönítjük; ez a fragmens a trp-operonból a promotort, az operátort, az L-peptid szerkezeti génjét, az attenuátort és a trp-E-szerkezeti gén első hat aminosavának kodonjait tartalmazza. A fragmenst Klenow-féle polimeráz segítségével dezoxinukleotid-trifoszfátokkal kiegészítjük, két végét a Hindin enzim számára felismerhető hellyel rendelkező oligonukleotiddel kötjük össze, majd HindlII enzimmel utóvágjuk. Az igy kapott HindlII-fragmenst a pBR 322 HindlII-vágóhelyébe ligáljuk. A kapott plazmid a ptrpE2-l plazmid [J.C. Edmann és mts-i, Nature 291 (1981) 503-506], amely az ott leirt módon ptrpLl plazmiddá alakítunk. A szintetikusan előállított (NI) és (N2) képletű oligonukleotidek segítségével 5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3’ (NI) 5’ CCT TTG CTT TCA TTG T (N2) (e két oligonukleotid az (N3) képletü kétszálú oligonukleotiddé épül össze: 5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3’ (N3) 3’ T GTT ACT TTC GTT TCC. 5’) a ptrpLl plazmid Clal-helyébe az L-peptid első három aminosavának megfelelő DNS-szekvenciát építjük be, és (lásd 1. ábra) további DNS bevitel céljából restrikciós helyet (Stul) létesítünk. A ptrpLl plazmidot a Clal enzimmel a gyártó előírása szerint reagáltatjuk, az elegyet fenollal extraháljuk és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az 5’-végeken lévő foszfátcsoportok eltávolítása végett a kinyitott plazmidot E. coli-ból származó alkálikus foszfatázzal reagáltatjuk. A szintetikus nukleotideket az 5’-végükön foszforilezzük és T4 DNS-ligázzal a kinyitott, foszfatázzal kezelt plazmidba illesztjük. A ligáz-reakció befejeztével a plazmidot E. coli 294 gazdasejtbe transzformáljuk, és a transzformált kiónokat ampicillin elleni rezisztencia és a Stul restrikciós hely megléte alapján szelektáljuk. A kapott kiónok mintegy 80%-a rendelkezik a várt restrikciós hellyel, és az 1. ábrán feltüntetett nukleotid-szekvenciát szekvencia-elemzés igazolta. A kész plazmid a PH120/14 plazmid, amelyben az L-peptid riboszóma-kötőhelye után az L-peptid első három aminosavának nukleotid-triplettjei (L1- -peptid) következnek, amelyekhez Stul-vágóhely csatlakozik. Az utóbbi további DNS beépítését és igy az L-peptid első három aminosavát tartalmazó fúziós proteinek előállitását teszi lehetővé. b) Az alábbiakban az alkalmazott (NI) képlete oligonukleotid példáján az ilyen oligonukleotidek kémiai szintézisét részletezzük. M.J. Gait és mts-i módszere szerint [Nucleic Acids Research 8 (1980), 1081-1096] a 3’-végen lévő nukleozidot - tehát jelen esetben a guanozint - a 3’-hidroxifunkción keresztül üveggyöngy hordozóhoz kapcsoljuk (CPG=controlled pore glass, LCAA=long chain alkyl amine, gyártja: Pierce) oly módon, hogy a guanozint N-2-izobutiroil-3’-0-szukcinoil- 5’-dimetoxi-trietiléter alakjában N,N’-diciklohexil-karbodiimid és 4-dimetilamino-piridin jelenlétében a módosított hordozón lévő hosszú láncú amin aminocsoportját acilezi. A következő lépésekben a bázis-komponenst. 5’-0-dimetoxi-tritil-nukleozid-3’-foszforossav-monometilészter-dialkilamid vagy -klorid alakjában alkalmazzuk. Az adenin N6- -benzoil-származék, a citozin N4-benzoil-származék, a guanin N2-izobutil-származék és ez aminocsoportot nem tartalmazó timin védócsoport nélkül kerül felhasználásra. 1 umol között guanozint tartalmazó 40 mg hordozót az alábbi vegyszerekkel kezelünk: a) diklór-metán, b) diklór-metános 10%-os triklórecetsav-oldat c) metanol d) tetrahidrofurán e) acetonitril f) a megfelelő nukleozid-foszfit 15 umolja és 70 pmol tetrazol 0,3 ml vízmentes acetonban (3 perc), g) 20%-os acetanhidrid 40% lutidint és 10% dimetilaminopiridint tartalmazó tetrahidrofuránban (2 perc), h) tetrahidrofurán, i) 20% vizet és 40% lutidint tartalmazó tetrahidrofurán, j) 3%-os jódoldat, kollidin, víz és tetrahidrofui-án 5:4:1 térfogatarányban készített elegyében, k) tetrahidrofurán, l) metanol. .Foszfif-on itt a dezoxiribóz-3’-monofoszforossav-monometilésztert értjük, amelynek harmadik vegyértékét klór vagy tercier aminocsoport, például diizopropilamino-csoport köti le. Az egyes szintézislépések hozamát a b) alatt végzett detritilező reakció után mérhetjük spektrofotometriásán, a dimetoxitritil-kation 496 nm hullámhosszon mért abszorpciója alapján. Az oligonukleotid befejezett szintézise után az oligomer metilfoszfát-védócsoportjait p-tiokrezol és trietilamin segitségével lehasítjuk. Háromórás ammóniáé kezeléssel az olit gonukleotidot elválasztjuk a hordozótól. A terméket két, három napon keresztül tömény ammóniával kezelve a bázisok védócsoportjait kvantitatíve lehasítjuk. A nyers terméket nagynyomású folyadékkromatográfiával vagy poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
