197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására
2 197351 3 A találmány tárgya eljárás genetikailag kódolható aminosavakból álló polipeptidek előállításának megkönnyítésére egy olyan szignálpeptid segítségével, amely egy propeptid alkotórésze. A propeptidet szignálpeptidázt tartalmazó Streptomyces-sejtben szignálpeptidre és polipeptidre bontjuk, a polipeptidet a sejtből eltávolítjuk és tenyészközegben kiválasztjuk. A találmány tárgyai továbbá a szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciák, ezen DNS-szekvenciákat tartalmazó génszerkezetek (amelyek ezt a DNS-szekvenciát a szerkezeti génnel leolvasó keretben tartalmazzák), az ilyen génszerkezeteket tartalmazó plázmidok, valamint az ilyen plazmidokat tartalmazó gazdaszervezetek. A P 3 331 860.3 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésben már leírtak egy eljárást a Streptomyces tendae fermentációjával történő tendamistat-elöállítására. Az eljárásban szubletális adag Acriflavinnal kezelt, tendamistatot termelő S. tendae törzseket alkalmaznak. Az így kapott törzsekből izolálnak egy, a tendamistat génjét tartalmazó DNS-fragmenset, mégpedig egy 2,3 kb-Pst I-fragmenset. Ezen fragmens Pst I-vel hasított pBR 322-be történő beépítésével tudják ezt a DNS-t E. coli-ban szaporítani és ismét izolálni. Felismertük, hogy ebben a 2,3 kb-fragmensben közvetlenül a tendamistat szerkezeti génje előtt az (I) általános képletü Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala (I) szignálpeptid (prepeptid) kódja van, az (I) általános képletben pedig X 17-20 aminosavat magában foglaló hidrofób egységet jelent. Felismertük továbbá, hogy ez a szignálpeptid alkalmas arra, hogy más peptideket a megfelelő szignálpeptidázt tartalmazó gazdasejtekből .kizsilipeljenA találmány ennek következtében a (II) általános képletü propeptidetre is vonatkozik. Sig-R (II) a képletben Sig az (I) általános képletben jellemzett aminosav sorrendet jelenti, R jelentése egy aminoterminálisan csatolt, genetikusán kódolható peptid maradéka, amelyben az amino-végen egy savanyú aminosav, előnyösen aszparginsav van. A találmány tárgya tehát egy olyan (II) általános képletü peptid, amelyben R jelentése hidrogénatom, vagy egy peptidmaradék, például tendamistat-maradék. A találmány tárgya a megfelelő DNS-szekvencía is, amelyet szubletális adag Acriflavinnal kezelt tendamistatot termelő Streptomyces tendae törzsekből nyerünk a következő előállítási lépésekkel: a teljes DNS izolálása, Pst I-el történő emésztetése, az 5’-(32P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3* (A) képletü DNS-szekvenciával történő Southern-hidridizáció, a 2,3 kb-Pst I-fragmens izolálása, Bam HI-vel történő hasitás, az (A) képletű DNS-szekvenciával történő Southern-hibridizáció, a 0,94 kb-Pst I-Bam HI-subfragmens izolálása, Sau 3a-val történő hasitás, az (A) képletü DNS-szekvenciával történő Southern-hidridizáció, a 0,525 kb-Bam HI-SAU 3a-subfragmens izolálása és a DNS-szekvencia megállapítása A találmány tárgyát képező DNS-szekvencia jellemzői: a) közvetlenül a tendamistat szerkezeti génje előtt helyezkedik el, b) az amino-végen a Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg sorrendet kódolja, c) a karboxi-végen a,z Ala-Ser-Ala sorrendet kódolja, és d) középen a 17-20 aminosavat tartalmazó hidrofób egységet kódolja. Ezt a DNS-szekvenciát a következőkben (B)-szekvenciának, illetve szignálpeptidnek fogjuk nevezni. A standard jelzőkkel történő összehasonlítással meghatározott kb-számérték pontossága a szokásos. A Southern-hidi-idizációhoz az (A) szekvencia helyett tetszőleges, a tendamistat-génnel vagy az ellenszállal komplementer szekvenciát választhatunk. A (B) jelű DNS-szekvencia jellemzésének különböző lépéseihez a DNS-t a gyakorlatban mindig egy alkalmas vektorba ültetjük, amelyet egy gazdasejtbe traszformálunk, ott szaporítjuk, az (A) szekvenciával történő kolónia-hibridizációval a transzformánsokat meghatározzuk, és a DNS-t újra izoláljuk. Ezek a lépések ismertek. A (C) jelű DNS-szekvencia, amelynek kódoló szálját a függelékben tüntetjük fel, a S. tendae tendamistat szerkezeti génjének nukleotid-sorrendjét mutatja. Az említett génszerkezetek tehát a (B) jelű DNS-szekvenciát leolvasókeretben tartalmazzák egy szerkezeti génnel, amely például a tendamistatot kódolja és ez előnyösen a (C) jelű DNS-szekvencia. A találmány tárgyai továbbá olyan plazmidok, amelyeket a (B) jelű DNS-szekvencia jellemez, leolvasókeretben egy szerkezeti génnel, amely például a tendamistatot, előnyösen a (C) jelű DNS-szekvenciát kódolja. Ezek a plazmaidok tartalmazhatnak E. coli-ban hatásos replikont és így képesek a DNS-t E. coli-ban szaporítani és adott esetben kifejezni is. Előnyösek azok a plazmaidok, amelyek egy, a Streptomycesekben hatásos replikont is tartalmaznak. Ha egy ilyen plazmiddal Streptomyces-t transzformálunk, akkor a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
