197348. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-ATGCAT-specifikus restrikciós endonukleáz előállítására
2 197348 3 A találmány tárgya eljárás 5-ATGCAT-specifikus restrikciós endonukleáz (SmucI) előállítására Streptococcus mutáns .c‘ szerotipusból. Ismeretes az, hogy a többnyire baktériumok által termelt szekvencia-specifikus endonukleázok - vagy az általánosan használt néven restrikciós endonuklenzok - a kettős szálú dezoxi-ribonukleinsavakon legtöbbször 4 vagy 6 nukleotidból álló kettősen szimmetrikus nukleotid szerkezeteket ismernek fel. Ezen enzimeknek a gyakorlatban használható csoportja által katalizált reakciókban használható csoportja által katalizált reakciókban a felismerő szekvencián belül vagy közvetlenül emellett DNS-hasitás megy végbe. Ismeretes az is, hogy a restrikciós endonukleázok jelentősége ebben a specifikus felismerésben és hasításban rejlik és ez tette lehetővé a legkülönbözőbb szerveződési szintű élő organizmusok öröklődósi anyagának vizsgálatát azáltal, hogy velük a gének a komplex génállományból izolálhatok, analizálhatók, rekombinálhatók, megváltoztathatók. A gének fizikai térképezésén kivül a restrikciós endonukleázok teremtették meg a génsebészeti technológiák alapját is. A restrikciós endonukleáz termelés száznál több baktériumfajból kimutatható. Számos ismert restrikciós endonukleáz azonos felismerő vágási hellyel rendelkezik. Ezeket az eltérrő fajokból izolált, de azonos szerkezetet felismerő enzimeket nevezik izoskizoméreknek. Az izoskizomérek létezése lehetőséget ad arra, hogy az optimális enzim megválasztásában gyakorlati vagyis gazdasági szempontok is érvényesüljenek. Az Anabaena variábilis alga által termelt Ava III elnevezésű restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciájának tulajdonságai miatt az ún. nagy specifitásu csoportba sorolható, így a génsebészeti kutatások egyik fontos eszköze. Az AVA III hátrányai a következők: a) Az Anabaena variábilis tenyésztése bonyolult, a bakteriológiában ritkán alkalmazott táptalajon történik. A tenyésztés ideje 8-10 nap, és egész idő alatt speciális megvilágítást és állandó széndioxid áramoltatást igényel (FEBS Letters 104. 39-14. 1979.). b) Az A va III a rendelkezésre álló adatok szerint nem állítható elő tisztán, ezért a gyártásával sem foglalkoznak. Az utóbbi időben megismert másik izoskizomer az Nsil restrikciós endonnukleáz, melyet a Neisseria sicca baktérium törzs termel. Ez az enzim is azonos helyen ismer fel és vág mint az előző, de a kereskedelmi forgalomban lévő preparátumok hátránya egyrészt a magas ár, másrészt az enzim instabilitása, gyors inaktiválódása. A találmány célkitűzése az Ava III-mal izoskizomer restrikciós endonukleáz előállítása, amely tiszta formában hozzáférhető és gazdaságosan gyártható. A találmány szerinti eljárás 5-ATGCAT-specifikus restrikciós endonukleáz előállítására azzal jellemezhető, hogy Streptococcus mutáns baktérium .c' szerotípusú törzsét (az Országos Közegészségügyi Intézetben, a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében 00 338 szánton, a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MIK 310/1986 iktatási számon) táptalajon tenyésztjük, majd fermen lié bői az enzimet tartalmazó sejteket ismert módon elkülönítjük és feltárjuk. A tenyésztést célszerűen aerob körülmények mellett végezzük. A találmány egyik előnyös változata szerint a tenyésztéshez szív-agy kivonatol használunk. A baktérium 22 °C és 40 °C között tenyészthető, előnyös a 37 °C. A ferment léből a sejteket ccnlrifugatással ülepítjük, a sejteket ultrahangos kezeléssel feltárjuk, majd az ultracentrifugálással tisztított fehérje-oldatból gélszűréssel, hidroxilapatit luoiiiatog ráfiéval, majd aminónium-szulfátos kicsapéssal és hidrofób kronuitográf iával, vagy alternatív módszerrel, ioncserélő kromatográfiákkal nyerjük ki a tiszta enzimet. A hivatkozott baktérium jellemzői: Mikroszkópos morfológia: többnyire 0,6- -0,8 mikrométer nagyságú diplococcus, kicsit elnyúlt lángnyelv alakú, fiatal tenyészetben folyékony táptalajban hosszú láncokat képez. Festődése Gram-pozitiv, a dégénérait alakok az öregedő ten>őszetekben Gram-negatívak is lehetnek. Telepmorfológia: sziv-agy kivonat (Brain-Heart Infusion, Difco) tartalmú agar lemezen, aerob tenyészetben, 37 °C-on 2 nap alatt kifejlődő 1 mm körüli átmérőjű fehér, gömbölyű, lassan növekvő telepek. Folyadék tenyészetben: 37 °C-on, aerob körülmények között iukubálva rázott tenyészetben egyenletes zavarodást okoz. Fenntartás: sziv-agy kivonatot tartalmazó ferde agar táptalajon hetenkénti átoltással, vagy raktározható -20 °C-on 50%-os glicerinben szuszpendálva. Preparatív baktérium termelés: a baktériumot önmagában ismert módon tenyésztettük, síkrázógéphen kevert kultúi’ában vagy rázás nélkül, húskivonatol, élesztő kivonatot és szív-agy kivonatot különböző kombinációkban tartalmazó táptalajokon. A baktériumtenyésztés 37 °C-on folyamatos keverés és rázás nélkül is optimális. A sejtek szaporodása az optikai denzitás mérésével 560 rím hullámhosszúságú fénnyel vizsgálva követhető. Amint a tenyészet elérte a logaritmikus fázis végéi, (ez a sziv-agy kivonat táptalajon tenyésztve, 10 nm-es küvettában mérve átlag 0,8-0,9 egységnél következik be, mog bouillon- élesztő kivonat táptalajon 0,6-0,6 egységnél), a tenyészetet jégfürdöben leb ütöttük, majd 0 °C-ori 30 percen keresztül 10 000 g-vel centrifugáljuk, a sejtmasszát 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
